荧光光谱分析法121220.

1、荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理第二节荧光定量分析方法第三节荧光分光光度计下村修:現年80岁的下村修1928 年出生于可本京都府.1960年 茨得名古屋丸学理学晦士学伐后 赴其，丸后卷美饵普林斯顿大学. 冰士顿丸学和伍査霍余海洋生杨 实脸所工作。他1962年从一科由于嫌色 发岀埒艳嫌木母中发现了挖光认誉为生杨发光研屯第一人。马丁沙余菲：马丁沙余菲出生于1947年，现年61岁，是美倒哥伦 比亚大学生杨学教授。他获樊的主要贡故&.于句人们展示了绿色 关光妥仓作为发光的遗传标签的作用，这一技术彼广臣运用于生 理学和氐学等领城。鶏典宣家科学fit壹布，美籍华裔科学家微永健、美国生肠学家马

2、丁沙余菲和Q本有机化学家兼海洋生扬学家下村修共同荻得2008 年度诺贝余化学奖.将均分1000万瑞典克胡C约金140万美元丿典 佥。犁助他们获奖的是绿色集光餐勺。这科餐自为生扬与医学实脸 带来革4，它发岀的炭光像一養碉灯，率助研克人员照売生Q体农 分子屋面和细胞层而的诘多反应。瞻2008年诺贝余化学奖般 2萤石(fluospar)而得名。亠1娄石(绿)某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时 间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比 较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的 矿物我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外 光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧 光。除了紫外光和可见

3、光可能激发荧光外，其它的光如红外光.X射线也可能激发出荧光，因此除紫 外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光 等。 ,ooSR-GL10NECKLACESR-GL01x 580mm 5a， aeorax 5®0«nm澳大利亚科学家最新发现 ,一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶。用荧光抗体染色之 原生动物K. Bretc et al. PNAS 94 (1997) 2306green-fluorescent protein (GFP)光致发光（二级光）。光致发光某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所

4、吸收光的波长更长的光荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。光学光谱区远紫外（真空紫外）近紫外可见光近红外中红外远红外10nm200nm200nm380nm780 nm380nm 780nm 2.52.5 gm50 pn50)ini300 gm分子荧光分析的特点:1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限约 为107g/mI,而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至 10 ,2g/mlo2. 选择性好3.线性范围宽4.应用范围第一节荧光分析法的基本原理一、分子荧光molecular fluorescence1.分子荧光的产生分子能级比原子能级复杂在

5、分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能层室温下大多数分子处于基态的最低振动能层在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的叫为+1/2和 1/2, *0, M=lo则该分子所处的电子能态称为基态单重态, 用符号S。表示£T激发态分子吸收辐射后基态 一! !基态激发单重态激发三重态T电千自旋状态t |电子被激发且不发生自旋方向的改变叫为+1/2和-1/2,5=0, M=lo则该分子所处的电子能态称为 激发单重态,用符号S表示。（S S2 S3.）电子被激发且伴随着自旋方向的改变叫为+1/2和+1/2,5=1, M=3o则该分子所处的电子能态称为 激发三重态，用符号卩表示。（7 T2）1

6、1£T£T小结：分子能级与跃迁基态（S°）T激发态:吸收特定频率的辐射;量子化；跃迁£T次到位;激发态-基态：多种途径和方式（见能级);速度最快、激£T发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大;第一、第二、电子激发单重态S2； 第一、第二、电子激发三重态卩八T2.；电子能级的多重性Af=2S+l平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），三重态能级比相 应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；12小结：激发单重态与激发三重态的不同猎激发单重态分子中没有净电子自旋,而具有反磁性;激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的激发单重态分子平均寿命短(10

7、10-),而激发三重态 的长(1010s)朱基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁50->51、S2允许跃迁;S0->Tn T2禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级进入的几率小;);能量吸收发射荧光S/SC2S.换发射磷光振动弛豫V激发态T基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径荧光:10710s,第一激发单重态的最低振动能级-基态 磷光：ms；第一激发三重态的最低振动能级基态”辐射和非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交

8、换形式由高振动能 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12S 内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间lOSo荧光发射=电子由第一激发单重态的最低振动能层T基态（荧光多为跃迁），发射波长为入的荧光，10入10嗚。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长:外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的非辐射跃迁。常发生在/或S.外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭” o系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 生变化的非辐射跃迁。禁阻跃迁，但当能层有较大重

9、叠时就可发生系间 跨越，通过自旋一轨道耦合进行。106s磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级-基态（巧 跃迁）；发光速度很慢：lOlOOsx磷光的能量比荧光小 电子由进入巧的过程：（s0-r,禁阻跃迁）激发-振动弛豫-内转移-系间跨越-振动弛豫T 光照停止后，可持续一段时间2.荧光的激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluorescence spectrum荧光分子都具有两个特征光谱: 激发光谱和发射光谱（荧光光 谱）。（1）荧光的激发光谱激发光谱：表示不同激发波长 下所引起物质发射某一波长荧光的 相对效率。绘制激发光谱:定发射波长（选最大发射波长），然

10、后以不同波长的入射光激发荧光物质，以荧光强度F对萊的激发光谱（I）、荧光 （II）和磷光（111）光谱图激发波长入作图，即为激发光谱。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强 度最大，称为最大激发波长九级（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强 度。绘制发射光谱时，使激发光波长固定在九、处，然后对发 射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度 F对发射波长九作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？激发光谱与发射光谱的关系a. Stokes位移荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波 长大于

11、激发光波长的现象。激发光谱与发射光谱之间的波长差值=振动弛豫、内转换等物辐射跃迁损失了部分能量。b.荧光光谱的形状与激发波长无关电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能级图；12、兄I），产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如;h。 为什么？距臨波长镜像规则C.镜像规则由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常 荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关，客小峰 的高度与跃 迁几率有关。基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 能级分布类似；基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 级的几率较大的话，相反跃迁也如此。惹的乙酵

12、溶液的荧光光it （右）和吸收光谱（左）图二、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure1 分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构;（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（q）=发射的光量子数吸收的光量子数如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。物质的荧光量子产率范围一般是多少?252 有机化合物的分子结构与荧光的关系(D跃迁类型：兀* T兀的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；(2)共辄效应：提高共觇度有利于增加荧光效率并产生红移(3)刚性平面结构：

13、可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光如荧光素和酚駄有相似结构，荧光素有很强的荧光, 酚駄却没有。*苯环取代英的荧光相对/度(乙醉洛液)(4)取代基效应：芳环上 有供电子基，使荧光增强。化合物分子式荧比波长秸/nm荧光的相对爱度*270- 31010甲苯c6h,ch5270 320)7丙苯27032017代c已F270- 32010氯代苯CHC1275- 3457代萃C*H,Br2903805碘代苯C0J0C”OH285 36518酚离子cji,o-310 40010苯甲C.HQCH)285 34520苯胺CJi5NH3310 40520苯胺离子c,h5nh;0甲腹CJi.CO

14、OH310 3903苯基C,H5CN280 36020硝*CHjNO.027三、影响荧光强度的因素relation between fluorescence and molecular structure影响荧光强度的外部因素1 溶剂的影响同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也 有所增强。这是因为在极性溶剂中，7TT於跃迁所需的能量差 E小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均 长移，强度也增强。溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁 增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温 度

15、对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此 温度上升，荧光强度下降。2 温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在（TC以下，温度每降低10°C, 0增加3%,在-809时，0f为1。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最

16、适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：pH<2pH7 12pH>13苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于-NH2为提高荧 光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pHv2和pH> 13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。4 内滤光作用和自吸现象内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铅酸钾；自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蔥化合物。葱的乙醇溶液的荧光光谱佑）和吸收光谱（左）图5 荧光熄灭剂荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互 作用引起荧

17、光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)o如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、拨基和竣基化合物均为常见的荧光熄灭剂。6、散射光小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生 改变而向不同角度散射。瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只 是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把 部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而 发射出比入射光稍长或稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须

18、采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发 光波长选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰320nm或350nm为激发光,荧光峰总是在448n m。将空白溶剂分别在320nm及 350nm激发光照射下测定荧 光，激发光波长为320nm时, 拉曼光波长是360nm, 360nm的拉曼光对荧光无影 响；当激发光波长为350nm 时，拉曼光波长是400nm, 400nm的拉曼光对荧光有干 扰，因而影响测定结果。3434荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范1.有机化合物的

19、荧光分析脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共辄体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性,常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物（衍生化）。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。34能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、蔡酚类、 嗥咻类、口引喙类、多环芳桂类、具有芳环或芳杂环结构的氨 基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、 麻黄碱、吗啡、哇咻类及异哇咻类生物碱等；綃体类如皮质 激素及雌醇等：抗生素类如青霉素、四环素等：维生素类如 维生素A、B、B2. B6. Bq E、抗坏血酸、叶

20、酸及烟酰胺等。 此外，中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的 大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光 试剂：1.荧光胺(fluorescamine):能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧荧光胺及其水解产物不显荧光。lOOmg荧光胺溶于100ml无水丙酮中，放置24小时后即可使用。取相当于lOmg药物的甲 水溶液0.1ml,加适宜pH值的磷酸缓冲溶液5ml,加荧光胺试剂O.Iml, 混合，放置15分钟后测定荧光强度。荧光条

21、件为：z?ex=275.390nm, A cm=480nm。2.邻苯二甲醛(OPA)在2-疏基乙醇存在下，pH910的缓冲溶液中OPA能 与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及径脯氨酸外的a-氨基酸生成灵敏的荧光产物。取OPA500mg溶于10ml乙醇中，力口200ml 2-疏基乙醇，将此混合液加至1L 3%的硼酸溶液中，再用KOH调节至pH10,即为常用试剂溶液。荧 光条件为：2 ex=340nm, A em=455nm。31-二甲氨基-5-氯化礦酰(Dansyl-Cl,丹酰氯)能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性产物。 取50mg或1 OOmg试剂，溶解于500ml无水丙酮中即可使用

22、。 与丹酰氯类似的一个试剂是丹酰B(Dansyl-NHNH2),它能 与可的松的按基缩合，产生强烈荧光。荧光条件为： A ex=365nm, A em=500nm左右。丹酰氯试剂不稳定，其水解产物Dansyl-OH呈蓝色荧光 ,必须暗处保存，每周重新配制。«XftW机化合检的英光测定法试M澈发光波长 nm荧光浚长测定耙HH c/(pg cm'3)nm丙三醉苯JR衆外xe0.1 29隆MM4655051.5-15M3654000-5睪基水杨駛flfcN,Nr- 一甲星甲験胺(KOH)3664103 x 1(T$ 5 x 10"4 mol dm 宀0.1 mol dm&

23、quot;1 NaOH紫外500紫外(365)485IO"10堆生余A无水乙IB3454900-20氨棊酸氣化等3154250.01 50盍白质睛红丫薰外5400.06-6腎上蘇囊乙二疲4205250.001 0.02MMTK邻華二IK3654700.05-5茨璃酸IW3乙酰氛基吋嗓3954700.001 0.033甘甲MM-6-M-9-(e-氮乙«)«基氮杂滋4205000.0625 0.625F111-*i40«XftW机化合检的英光测定法#«XftW机化合检的英光测定法2 无机化合物的分析无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配 合

24、物后，可测量约60种元素及离子披、铝、硼、掾、硒、镁、稀土采用荧光分析法#«XftW机化合检的英光测定法氟、硫、铁、银、钻、臻采用荧光熄灭法测定铜、铁、钻、餓及过氧化氢采用催化荧光法测定 辂、锭、铀、确一采用低温荧光法测定篩、铸、镁、仏铀采用固体荧光法测定#第二节荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系由于能产生荧光的物质占被分析物的数量相当有限, 且就这少量的荧光物质几乎在同一波长段产生光致发光, 所以荧光法很少用来定性分析当一束强度为 的紫外/可见光照射一浓度为、液层厚 度为的液槽时，可在溶液的各个方向观察到荧光，其吸收光强度为人透过光强度为厶 荧光强度为垂直方向41荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度人(=/0./t)F = (70-Zt)取决于荧光效率处根据Beer Law 卡=10_fcZF = K'Qo-/oXlO"Z)= /C7o(l-lOz)= K7o(l-e 一 2303G)由于 ex =l+x+x2/2!+x3/3!+.+x"/n!所以 &23G=i 2.36T/+ (-2.3£cl) 2/2!+ (-2.3£r/)