DNA分子标记在竹子分类研究中的应用

1、D NA 分子标记在竹子分类研究中的应用郑 蓉 1,2, 郑维鹏 2, 方 伟 3(11北京林业大学资源与环境学院 , 北京 100083;21福建省林业科学研究院 ,福建 福州 350012; 31浙江林学院 , 浙江 杭州 311300摘要 :简述了 DNA 分子标记技术的种类 、 原理和特点 , 概况了竹子分类研究存在的问题与现状 , 并综述了分子标记技术在 竹类植物的起源 、 遗传多样性 、 种间或属间遗传关系 、 品种鉴定 、 构建遗传图谱等方面的应用与前景 。关键词 :DNA 分子标记 ; 竹子分类 ; 植物分类中图分类号 :S795101 文献标识码 :A 文章编号 :1002-

2、7351(2006 03-0161-05Application of D NA Molecular Markers in Studying B amboo ZHENG R ong 1, 2, ZHENG Wei 2, Wei 3(11College of Resources and Environment , Beijing , , China ;21Fujian Academy of Forestry , Fuzhou , Fujian 350012, Hangzhou , Zhejiang 311300, China Abstract :The paper summarizes the s

3、 molecular markers ,and points out the problems as well as current situation of , the application and foreground were reviewed using DNA molecular the on the ori gin , genetic polymorphism , genetic relationships ,identification of breeds K ey w ords :DNA marker ; bamboo toxonomy ;plant toxonomy 经典的

4、植物分类是采用植物形态学及解剖学的方法 , 从植物的外部形态及组织构造来划分植物类型 。 但同种植物在不同的生境条件下外部形态 、 组织构造等都有可能发生改变 , 因此形态性状用于种的分类时 具有很大的不可靠性 (G ordon ,1976; Fowler et al 1,1988 。植物分类学发展至今 , 发展了实验分类学 、 细 胞分类学 、 化学分类学 、 数量分类学等方法 , 到 20世纪 80年代 ,DNA 分子标记技术被应用于植物分类研 究中 , 成为实现现代植物学研究的一个新的技术手段 。1 DNA 分子标记技术简介DNA 分子标记是以 DNA 多态性为基础的一种遗传标记 。 它

5、可以检测到植物体 DNA 水平上的差异 (Debener ,2002 , 不因为生长阶段和环境因素的改变而改变 , 甚至可区分不同品种或个体 。有研究表明 , 植物在长期进化过程中产生的可遗传变异都是由于 DNA 序列变异而造成的 1。DNA 分子标记与 3种常规标记技术 (形态标记 、 细胞学标记 、 生化标记 相比具有以下优点 : 多态性 高 ; 遍布整个基因组 ; 检测手段简单 、 迅速 ; 无基因多效性 ; 能够明确辨别等位基因 ; 实验重复性 好 ; 直接以 DNA 的形式表现 , 避免时空限制 。迄今已有 30多种 DNA 分子标记技术相继出现 , 植物 DNA 分子标记技术及其应

6、用研究也取得了令人瞩目的进展 , 广泛地应用于植物分类 、 亲缘关系 、 种质资源 遗传多样性 、 系统演化及遗传育种等研究领域 , 目前常用有 RFL P 、 RAPD 、 SSR 、 AFL P 等 。111 以分子杂交技术为核心的 DNA 分子标记RFL P (Restriction Fragment Length Polymorphism 发展最早的基于 Southern 杂交技术的分子标记 , 自 Bostein 和 White 于 1980年利用限制性内切酶片段长度多态性构建人类遗传连锁图 , 奠定了分子标记 技术研究的基础 。 其原理是检测 DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定

7、 DNA 片段的大小 , 具有共显性 特点 , 其操作较复杂 , 效率低 , 成本高 , 不易获得足够有效的探针 。 目前已在马铃薯 、 水稻 、 番茄等多种作物 收稿日期 :2006-06-26; 修回日期 :2006-07-25 作者简介 :郑 蓉 (1972- , 女 , 福建莆田人 , 福建省林业科学研究院工程师 , 在职博士生 , 从事竹类研究 。第 33卷 第 3期2006年 9月 福 建 林 业 科 技 Jour of Fujian Forestry Sci and Tech Vol 133 No 13Sep 1, 2006中构建了 RFL P 连锁图谱 。112 以 PCR 为

8、基础的 DNA 分子标记11211 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA 1990年 williams 与 Welsh 首先创建 RAPD 技术 , 通常采用 10个碱基的寡核苷酸作引物 , 不同来源的 DNA 与引物具有不同的结合位点 , 在 RAPD -PCR 反应中可获得不同的扩增产物 , 再经凝胶电泳分离 。这种标记继承了 PCR 的优点 , 简便迅速 , 实验成本 低 ; 缺点是不能鉴别杂合子和纯合子 , 重复性较差 , 检测位点不多 。11212 SSR (Simple Sequence Repeat 引物根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列

9、设计 , 可依据微卫 星寡核苷酸的重复次数在同一物种不同基因型间的差异 , 提示长度多态性 。 它是检测多态性的有效方法 , 被应用于植物遗传图谱的构建 , 种质鉴定 , 杂交种纯度鉴定 ,Q TL 分析及分子标记辅助育种等 。 SSR 基础 上相近的种类有 : ISSR (Inter -Simple Sequence Repeat 技术 ; 把 SSR 互补的寡核苷酸作为多位点 RFL P 技术中的探针 ; RAMS ; RAMPs 。11213 AFL P (Amplified Fragment Length Polymorphism 1993年 Zabeau 和 Vos , 将 RFL

10、P 技 术与 PCR 技术结合起来 , 先将基因组 DNA 双酶切 , 经 PCR 。适用于分类 研究及绘制品种的指纹图谱 , 比 RAPD 稳定性好 、 。11214 STS (Sequcncc Tagged Site 通过 RFL P , 构建 PCR 引物 , 经 PCR 扩增寻找多态性 。 其信息量大 , 。11215 ITS (Internal Transcribed 18S 、 518S 、 28S 编码区具有非常保守的区 域 , 通过特异物对 , , 计算序列相似性 , 对生物亲缘关系进行分析 。其他的 :SPAR (Single Primer Amplification Rea

11、ction 、 SCAR (Sequence Character 2ized Amplified 、 SN P (Single Nucleotide Polymorphism 、 IFL P (Intron Fragment Length Polymor 2phism 、 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence , 、 SSCP (Single -strand Conformation Polymor 2phism 等 。2 竹子分类学研究存在问题与现状竹类植物是禾本科 (Gramineae 竹亚科 (Bambusoideae 植物的总称 ,

12、全世界有竹类植物 (不包括草本竹 类 70多属 1200多种 , 主要分布在亚洲 、 非洲和拉丁美洲的热带 、 亚热带区域 , 包括中国在内的东南亚季 风区为竹类植物园的中心分布区 。 竹类资源作为陆地上森林资源的重要组成部分 , 全球竹林面积 2000×104hm 2以上 , 约占世界森林总面积的 1%。竹子研究的突出问题始终表现在竹子的分类学研究 。自 1788年 11月瑞典人 A 1J 1Retzius 发表竹 属的先驱属名 Bambos 以来 , 竹类因为其独特生长发育规律 , 绝大多数竹种开花周期长 , 尤其是花小而且 特化 , 竹子开花后就会导致竹株乃至全林死亡 , 有的

13、竹种开花但不结实 , 这些原因都决定了以花 、 果实等形 态为主的传统植物分类方法对竹子分类研究带来重重困难 。 鉴于此 , 竹类分类学者借助运用营养体中比 较稳定的特征来辅助竹类植物的分类 。 现有竹类植物分类系统可分为 2大类 :一类是以花 、 果为主要分类 依据的分类系统 , 以 Munro 系统为基础 ; 另一类是以耿氏分类系统 (1957 为基础 , 将生殖器官中的花序类 型与地下茎类型和分枝类型等营养体特征相结合 , 作为分类等级的依据 。由于分类系统的不同 , 一些属的系统位置就会发生变化 , 而且外部形态易受环境因素及个体发育情况 的影响 , 其分类的可靠性也会受到不同程度的限

14、制 。 同一竹种的花枝和营养体被分别发表为新种 , 甚至在 不同的属内作为新种发表 ; 很多竹种可能会在不同的名称下加以描述 , 或者以同一名称来命名颇不相同的 竹种 (D 1Grosser 和 W 1Liese ,1971 。 另外 , 竹类研究界对属的界限范围 , 竹种间形态性状变异的允许范围 等也缺乏一致的标准 。 如散生竹的分布范围广泛 , 其形态特征表现错综复杂 , 属间界限连续不断 (陈守良 等 ,1983 ; 散生竹分类中最大的问题反映在青篱竹属 (A rundi naria 分类的混乱上 (杨光耀等 ,1993 。为 此 , 传统的竹子分类在学术上的争议一直存在而无法解决 2。

15、从多学科手段上寻找可用于竹子系统分类的证据一直是植物学家们努力的方向 。 刘友全 (1986 对竹 261 福 建 林 业 科 技 第 33卷类叶肉细胞的形态比较分析 。 耿伯介 、 温太辉 (1989 依据竹类营养体 (地下茎 、 芽和枝 、 秆箨 、 维管束解剖 形态 分类 , 得出中国竹类营养体分属检索表 。 方伟 (1989 对部分国产竹材比较解剖研究 。 李升峰 (1989 利用酯酶同工酶和过氧化物酶工酶对青篱竹属中的竹种进行属种间亲缘关系的探讨 。 袁文海 (1993 等对 刚竹属 (Phyllostachys 进行淀粉酶同工酶的研究 。胡成华等 (1990,1994 对竹类植物根

16、部解剖特征和果 实胚胎学特征进行了研究 。 丁雨龙等 (1994 研究表明叶的解剖构造在属间无明显的界限 , 认为单一地将 竹子叶片某个部位的解剖构造的资料应用于竹类植物的系统分类意义不大 。 王正平 (1997 从地下茎 、 秆 、 枝 、 芽 、 秆箨等作为鉴定和分类的重要依据 , 将国产竹亚科的属分为 4簇 。王润辉 (2002 发现气孔保卫细 胞乳突的数目和分布具有一定的分类价值 ; 认为将绿竹亚属 (B am busa subgen 置于竹属 (B am busa 比 单独成立绿竹属 (Dendrocalamopsis 更为合理 。 李秀兰 (2001 对中国 13属 94种丛生竹类

17、的染色体数目 研究 。 张汉尧 (2005 借助于数量分类学的手段研究云南部分竹种形态标记数量分类 。3 分子标记在竹子分类研究上的应用竹子分类研究取得了很大的成绩 , 但属种分类等问题依然存在 。 学研究方法的结合 , 有望将一些问题得以解决 。 目前 、 遗传多样 性 、 种间或属间遗传关系 、 品种鉴定 、 。 311 种属遗传多样性与亲缘关系鉴定, 。 DNA 分子标记技术所获得 , , 计算遗传距离或相 似系数 , 。国外 Marulanda 等利用 AFL P 技术分析了美国大型材用竹瓜多竹 (Guadua angustif o 2lia S tkiata 及其近缘属的遗传多样性

18、, 发现瓜多属 (Gudaua 存在明显的遗传分化 , 扩增出的 162条带中 有 70%表现为多态 , 近缘属中 (Guada am pexif olia 内也存在较高的遗传多样性 。 Loh 等 3运用 AFL P 技 术 , 针对竹亚科中竹属 、 麻竹属 (Dendrocalam us 、 巨竹属 (Gigantochloa 、 泰竹属 (Thy rsostachys 的 15个竹种成功地根据 AFL P 产生的特异性条带得到了不同竹种之间的亲缘关系 。 Trevor &Stephen4运用 ITS 序列与 AFL P 分子技术研究刚竹属种间亲缘关系 , 测定了刚竹属 20个竹种

19、的 ITS 序列 , 运用 AFL P 分子标记方法分析 、 比较 。 Lai 等将 RAPD -PCR 技术应用于台湾重要经济竹种的无性系鉴定及遗传变 异分析 。312 验证传统分类地位并提出新分类的理论依据一些竹种的分类地位一直存在着争议 , 用传统分类方法未能得到解决 ,DNA 分子标记正好弥补了这 个不足 , 从分子水平上铺助确定它的分类地位 。庞延 军 等 5, 利 用 RAPD 技 术 研 究 发 现 少 穗 竹 (Oligostachyum sulcat um 和 糙 花 少 穗 竹 (Oligostachyum scabrif lorum 聚类分析 (结合水平为 01524 的

20、结果与传统分类高度吻合 , 从分子水平上 将酸 竹 属 (A ci dosasa 和 少 穗 竹 属 (Oligostachyum 合 并 的 可 能 性 得 到 认 同 , 支 持 将 肿 节 少 穗 竹 (Oligostachyum oedogonat um 独立出来成一属 。杨光耀等 6利用 RAPD 技术分析结果表明 : 苦竹 (Pleioblast us am arus 与宜兴苦竹 (Pl 1yi xi ngenis 关系密切 ; 大明竹 (Pl 1gram i neus 与其它 4种关系较 远 ; 形态分类上将中 、 日产苦竹分成 2类没有得到 RAPD 分析的支持 。另外 , 用

21、同样的方法探讨了倭竹 簇 (S hibetaeae 8个属的属间关系 , 认为大节竹属 (Indosasa 和唐竹属 (S i nobam busa 、 方竹属 (Chi 2monobambusa 和筇竹属 (Qiongz huea 关系密切 , 这与形态学的分类结果一致 ; 而基于形态研究 , 在倭竹簇 内建立刚竹亚簇 (Phyllostachydi nae 和倭竹亚簇 (S hlbataei nae 或唐竹亚簇 (S i nobam busi nae 和倭竹亚簇 的观点没得到 RAPD 分析的支持 , 此研究为解决倭竹簇中形态分类上存在的分歧提供新的分子依据 7。 李淑娴等 8利用水稻微卫

22、星引物对巴山木竹属 (B ashania 与近缘属及属下种进行分子分析 , 认为属下分 类等级的各个竹种其聚类结果与传统分类学的结论较和谐 , 从巴山木竹属与近缘属的距离来看 , 在分类上 巴山木属作为 1个单独的属可成立 , 也明确了茶秆竹 (A rundi naria am abilis 的分类学位置 。本研究利用 361 第 3期 郑 蓉 , 等 :DNA分子标记在竹子分类研究中的应用现代分子生物学技术对广义青篱竹属的系统学研究提供了一个借鉴 。在国外 ,Clark et al 1(1995年 测定了禾本科竹亚科的 6个亚科 NADH 脱氢酶的基因序列 , 并对其系 统演化关系进行研究探

23、讨 。313 品种或栽培类型鉴定对不同品种精确的系统学区分是种质资源保护和品种改良的基础 。竹子多数采用无性繁殖繁衍 , 许 多品种或栽培类型之间仅依靠传统的形态特征来鉴别具有不可靠性 , 而通过 DNA 分子标记来鉴别就比 较容易 、 准确 。方伟等 10对雷竹 (Phyllostachys praecox 的 l9个栽培类型及 2个近缘种进行了 RAPD 分析 。分子标 记技术可将雷竹的不同栽培类型及近缘种区分开来 , 如永嘉雷竹不属于 Ph 1praecox 种系 ; 提出了 RAPD 可对竹类植物种以下等级进一步分类 9。 师丽华等对毛竹种下等级进行了 RAPD 分析 , 发现 7个毛

24、竹种 下等级亲缘关系较近 , 而同属的圣音毛竹与毛竹的遗传距离较远 , 与形态上划分相一致 。在国外 ,Friar 等 11应用 RFL P 方法对 26种竹子的 42, 根据品种 间亲缘关系的远近 , 鉴定出 25种为散生竹 。 另外 , 对刚竹属 1936P 分子标记也 进行了较为深入的研究 。 Lai 等 12利用 RAPD Ph 1heterocycla var 1pubescens 样品分析 , 共鉴定出 9个毛竹无性系 , 8而产生的 。314 构建指纹图谱DNA DNA 经酶切后 、 电泳分离 、 用标记的 DNA 探针杂交 、 群体和物种的特异性和可区别性 , 通过制备出对该种

25、高度特异性 , 可以达到鉴定目的 。 因此 , 通过对竹种的分子遗传图谱作图 , 构建 DNA 多态性 , 筛选出反映竹种或品种特征的指纹图谱 , 作为竹种分类与鉴定的分子依据 。吴益民等 13借助 RAPD 技术分析孝顺竹 (B am busa glaucescens 、 凤尾竹 (B 1glaucescens var 1vivier 2corum 、 绿竹 (B 1ol dhami 、 白绿竹 (B 1m ulti plex 4个品种的 DNA 多态性 , 初步构成反映种特征的 RAPD 指纹图谱 , 为竹种鉴定提供分子水平的科学依据 。4 结论与展望DNA 分子标记作为一种新的遗传标记

26、, 具有更高的可靠性 、 高效性和更好的精确性等优点 , 同时更加 精确高效的植物遗传标记技术不断出现 , 如 SRAP (sequence -related amplified polymorphism 作为一种新 型的基于 PCR 的标记系统 , 被认为是评价遗传多样性 、 品种鉴定和系统发生的有效工具 , 已在水稻 、 马铃 薯 、 小麦 、 大麦等植物中成功应用 14, 相比其它作物 ,DNA 分子标记技术在竹子分类研究领域的应用有待 进一步探讨 。 此外 ,DNA 分子标记技术不能完全取代其它竹分类方法 , 不足之处在于 : 鉴定竹种的取样 仍需借助如形态学标记技术等方法 ; 目前采

27、用的分子标记大多所标记的仅是 DNA 片段 , 检测到单个碱 基差异的研究较少 ; 分子标记技术要求较高的技术设备和一些相关的研究基础 。综上所述 , 随着分子生物学理论 、 技术和方法的迅速发展 , 竹子的分子生物学研究将有着广阔的应用 前景 , 利用 DNA 分子标记开展竹种间 DNA 水平上遗传变异研究 , 从分子水平上对竹类植物进行分类和 辨别 , 同时结合经典分类学方法 , 为澄清和解决竹子一些属分类混乱以及种的归属问题 , 在竹子形态学上 的分类结果提供了分子依据 。 竹种的分类鉴定从宏观到微观研究 , 从形态学 、 细胞学 、 生物化学方面的研 究发展到 DNA 水平上研究 ,

28、并已有了很大的发展和进步 , 但还需要做大量的基础研究工作 , 竹子分类鉴 定技术也应不断吸收 、 利用新的技术方法 , 使其分类鉴定的方法相互融合 , 互相补充 。参考文献 :1卢向阳 1分子生物学 M 1北京 :中国农业出版社 ,200412江泽慧 1世界竹藤 M 1沈阳 :辽宁科学技术出版社 ,20021 461 福 建 林 业 科 技 第 33 卷3LohJin Phang ,Ruth K iew , Ohm Set ,et al 1A study of gentic variaton and relationships within the bamboo subtribe Bambu

29、si 2 nae using amplified fragment length polymorphismJ1Annals of Botany ,2000,85:607-61214Trevor R Hodkinson et al 1A Comparison of ITS Nuclear rDNA Sequence Data and AFL P Markers for Phylogenetic Studies in Phyllostachys (Bambusoideae , Poaceae J1Journal of Plant Research ,2000,113:315庞延军 , 杨永华 ,

30、胡成华 , 等 1从 RAPD 看肿节少穗竹的分类地位问题初探 J1南京大学学报 :自然科学版 ,1998,34 (5 :531-53516杨光耀 , 赵奇僧 1苦竹类植物 RAPD 分析及其系统意义 J1江西农业大学学报 ,2000,22(4 :551-55317杨光耀 , 赵奇僧 1用 RAPD 分子标记探讨倭竹簇的属间关系 J1竹子研究汇刊 ,2001,20(2 :1-518李淑娴 , 尹佟明 , 邹惠渝 , 等 1用水稻微卫星引物进行竹子分子系统学研究初探 J1林业科学 ,2002,38(5 :42-481 9方 伟 , 何祯祥 , 黄坚钦 , 等 1雷竹不同栽培类型 RAPD 分子标

31、记的研究 J1浙江林学院学报 ,2001,18(1 :1-51 10师丽华 , 杨光耀 , 林新春 , 等 1毛竹种下等级的 RAPD 研究 J1南京林业大学学报 ,2002,26(5 :65-68111FriarE , K ochert G 1A study of genetic variation and evolution of Phyllostachy (Bambusoideae :Poaeeae using nulear restric 2 tion fragment length polymorphismsJ1Theoretical and Applied G enetics ,1994, (89 :265-270112LaiC C ,Hsiao J Y 1G enetic variation of Phyllostachys pubescences (Bambu