拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用

1、 姜威中山大学硕士论文拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲项病毒(BCTV作用机制的研究表2.1显示共转化酵母在CMLeuTrp和CMLeuTrpHis平板上生长情况以及进行xgal检测结果,实验结果表明,在酵母双杂交体系中,c2蛋白是能够分别和Ferrodoxin蛋白,AP2蛋白以及SAMDC蛋白发生相互作用的。表2-1验证蛋白相互作用酵母双杂交实验结果 AP2基因(AtlG53910序列(1077bp:GGACT AAAQCT TTC CT AA AAflGAGCA OGA CAGCCTTG TTT AGC 0T AC TO TTC 0ACGCT G0TCG TTC GTC AAACT

2、CAQ CGT G0AACGC CCA TTC T0GC 0CT GCT TTCAC TQ0TTTT 0CAA GP'T CCC GGC TAC GAT GAA OCT TCT OT ATG ACA CG CCO CTG 0G GAA AQTTCC TGG CBT TTC GTT OTC BAT 0GG 0G 8CT 0TO AG BCT GAG TCC AOT ACT TTT CCTCCT GATTT CTG TTC GT OAT 0CT GCTCAA OCT TC CCT CTT C0CAA GCT TTC TC eCC AC CT CT24CCA AG TTC TCG GTG G

3、CG GAG COT 0OAT GACAQ AC OTG OOA GAT TCT AAT ACT CAG TCCCCO AAG GAT TCT AAA GAA AAA CCT TC GCT GAAA TCG 0C TOT TGT TCT CCA RAA GC TGCCG T TTT ATC CCA GOT TCT TGO TOG GCA AAC CCA AAC AAC AAT TCG GCG QCT TGQ AAT TTA00TT0GC GAT TTC TCGCA GGCTT 0CG CT0GTG ATC AAC 000GG GTT 0GC GGT 0GTCT AAGCT TOC GTT GT

4、T AAT AAA 00CG0AG GCT TCC AC TT TTT TC A0GCT GCA GGCOC GGA GG GT TTC TTT A口0TGG C0AGA GCT AAA TTT AAC CG GGT AAC CTC TCA AAC GTCC T T TCC0r T CTC r T CC G T TC CG O C T T GGO GGG O T0C G T GGT GeC C GTT T0T T C 0CC CT C G TGC A G C TT T G T 00擀搿尝兰吾嚣黼涨擀僦擗吾萋嚣麟搿差毫黑器量慰氍TT0T G G O T G TT C T 0C C C T T O

5、G CG CT 0CT G T 0B GTGC TCTTGT G T G C T T T G T C C T TC T 0C G GT CT G C TC 0A C T C T C T TGG0TC0TTCCT 500bp250bp23图2-4酵母表达载体pGBKT7一C2酶切电泳图Lanel:lkb DNA LadderLane2:pGBKT7.CJ Sal I和EcoR I双酶切Lane3:pGBKT7-CJ Nde I和EcoR I双酶切pGBKT7一C2-N上海博亚公司测序结果:ccq qaa七tt qta ata cqa 口a目ca口aa目cta atc tca ctc act at

6、a ggg cga 口aa aa口口ac cEa caCTCA GCA GGT TCT AAG AGA TTAGCTCCTTTGTGTGGAGTAAGGTACATCACACACTTCACTAAAAAGATTGCTCCATCCATTAAGCATGTATCACAGCGTCATACATTAATATCTeCTGAATATAATTCGCGCTGTTATCAGCCAAAGAATgcc gca taa cta gca taa ccc ctt ggg gcc tct aaa cgg ggt ttt ttg cgc gct tgc agc oa8gct aat tcc ggg cgpGBKT7一C2一C上海博亚

7、公司测序结果(230bp:ccq qaa ttt qta ata c口a ctc act ata口q cqaqaq caq aaq ctq atc tca寸a町qaq qac ctq caCTTC CGG CCT CCG CAC TGG GAA AAA GCC AGTCAA ATAATC GCAGAG ACTTTA TCA ACT GAACTT GAA TCT TCACAG GAC ATT AACAGA GAT ATA CTTAGT CeACAA GTGTGG GGAGGA TAAGATCTGgtc ttgAAGTTACTeTGT出gogaggcc gcc acc atg gCCA GGA C

8、TT CTT CCGAAG ATT CAA CCA CAAGAT AGA TTT GAC GATgtcaaCggccat ttt aaCtgctaggogca匕cttaaCgcaCCCgccttga89gggctacc匕attctacoggac ctg cag cgg ccgggg tct tga ggg gttgaa4806¨4l922402llj36jl44】247O4l9614JI922402S Sjj6,￥4GCCT一;“GGAT一强姓%凹CGAAAA盯肼他强AACCGT蛆姐加强"GCTACT盯%淞仲强GTAATC:受凹" ” 姜威中山大学硕士论文拟南芥F

9、errodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV作用机制的研究Ferrodoxin一5引物和Ferrodoxin一3引物旦堡芷塑.7bpl -蛐一¨dIldLane l:Ferrodoxin片段Lane2:lkb DNA Ladder32Ferrodoxm 10000-750p 2500一一8000bp 500_250-Lanel:lkb DNA LadderLane2:pGADGH/EcoR I和Xho I双酶切一447bp图2-11pGADGH-Ferrodoxin菌液克隆PCR检测电泳图Lanel:lkb DNA LadderLane27:pGADGHFerrodoxin菌液PC

10、R克隆检测l2 ￥00-300bp图212酵母表达载体pGADGH-Ferrodoxin酶切图谱Lanel:lkb DNA LadderI和EcoR I双酶切Lane2:pGADGH-Ferrodoxin/Nco为了研究C2蛋白与Ferrodixn蛋白发生作用的结构域,构建了pGADGHFerrodoxinN利pGADGHFerrodoxinC两个表达载体,构建示意图如图2-13所示。表达载体pGADGHFerrodoxinN的构建路线图如图2-14所示。表达载体pGADGHFerrodoxinC的构建路线图如图2一15所示。SlmI Neol Xhol DG冉量畦卜F毫rpodoxin(1一

11、哇哇7pGAIGltFerrodoxinK(t-154I孵AIGIt-Ferrodoxin-C(154447图213酵母表达载体pGADGH-Ferrodoxin构建示意图35 酵母双杂交技术是90年代兴起的一种研究蛋白质之问相互作用的新技术。依据真核转录凶子的DNA结构域与活化域分离的特性,将靶蛋白和诱饵蛋白分别与二者结合。只有靶蛋白与诱饵蛋白可相互作用时,转录因子所调控的报告基因才能表达。所以依据报告基因表达与否,即可判断靶蛋白与诱饵蛋白之间是否作用。通过本实验,运用酵母双杂交方法,证明了C2蛋白可以分别和AP2,SAMDC 以及Ferrodoxin蛋白发生相互作用,另外还证明了Ferrodoxin蛋白与C2蛋白发生作用的结构域分别为Ferrodo