课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (3)

1、一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸吸收。收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) ) 2 2脲酶脲酶+ H+ H2 2OO+ CO+ CO2 2NHNH3 33 3、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多

2、少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌二二.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照（1 1）依据：根据它对）依据：根据它对生存环境生存环境的要求，到相应的环境的要求，到相应的环境中去寻找。中去寻找。（2 2）实例：）实例：PCRPCR过程中用到的耐高温的过程中用到的耐高温的Taq DNATaq DNA聚合聚合酶，就是从热泉中筛选出来的酶，就是从热泉中筛选出来的TaqTaq细菌中提取出来的。细菌中提取出来的。筛选菌株的思路筛选菌株的思路1 1、自然界中目的菌株的筛选、自然界中目的菌株的筛选2、实验室中目的菌株的筛选：、实验室中目的菌株的筛选：

3、（2）方法：）方法：利用选择培养基利用选择培养基选择培养基选择培养基人为提供允许特定的微生物生长，同人为提供允许特定的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（1 1）原理：）原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他种类微等），同时抑制或阻止其他种类微生物生长生物生长。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4

4、 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4分析：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：分析：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才能分的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，分解尿素，缺乏氮源而

5、不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理实例：实例：加减成分加减成分加青霉素加青霉素等抗生素等抗生素加高浓度加高浓度食盐水食盐水不加氮源不加氮源不加碳源不加碳源以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源以纤维素以纤维素为唯一碳为唯一碳源源分离的菌分离的菌种种真菌真菌金黄色葡金黄色葡萄球菌萄球菌固氮微固氮微生物生物自养微自养微生物生物尿素分尿素分解菌解菌纤维素纤维素分解菌分解菌.统计菌落数目：统计菌落数目：1.1.常用方法：稀释涂布平板法常用方法：稀释涂布

6、平板法原理：原理：在在稀释度稀释度足够高时，微生物在固体培养基上足够高时，微生物在固体培养基上所形成的所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单细胞一个单细胞繁殖而成的，即一繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞；通过统计平板上的个菌落代表原先的一个单细胞；通过统计平板上的菌菌落数落数来推测样品中大约含有的活菌数。来推测样品中大约含有的活菌数。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M代表

7、稀代表稀释倍数。释倍数。（3 3）注意事项）注意事项为了保证结果准确，将为了保证结果准确，将同一稀释度加到三个或三个同一稀释度加到三个或三个以上的培养皿中以上的培养皿中，一般选择菌落数在，一般选择菌落数在3030030300的平板的平板上进行计数，并取上进行计数，并取平均值平均值。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低，低，原因是当两原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个一个菌落菌落。设置对照：主要是排除实验组中设置对照：主要是排除实验组中非测试因素非测试因素对实验对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的

8、影响，提高实验结果的可信度。设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。. .设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：土样不同，培养基

9、污染或操作失误原因：土样不同，培养基污染或操作失误( (或者是或者是混入了其他的含氮物质混入了其他的含氮物质) )小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。对照的设置是必不可少的。方案二：方案二：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案一：方案一：将将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一

10、致，则证明A无误；如果无误；如果结果不同，则证明结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有同学存在操作失误或培养基的配制有问题。问题。2 2、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血细胞计数板血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。微生物的数量。显微镜直接计数法显微镜直接计数法稀释涂布平板法稀释涂布平板法主要用具主要用具显微镜、血细胞计数板显微镜、血细胞计数板培养基培养基计数依据计数依据菌株本身菌株本身培养基上菌落数培养基上菌落数优点优点计数方便、操作简单计数方便、操作简单计数的都是活菌计数的都是活菌缺点缺点死菌活菌都计算在内死菌活

11、菌都计算在内操作复杂，有一定误差操作复杂，有一定误差二二. .实验设计及操作提示实验设计及操作提示（一）实验设计（一）实验设计 （1 1）土壤取样）土壤取样（2 2）制备培养基：）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。（3 3）样品的稀释）样品的稀释分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同( (p24p24资料二资料二) )目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板（4 4）取样涂布）取样涂布如果得到了如果

12、得到了3 3个或个或3 3个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030030300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。（5 5）微生物的培养与观察）微生物的培养与观察( (p24p24资料三资料三) )在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取选取菌落数目稳定菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时的记录作为结果，以防止因培养时间不

13、足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。 性状、大小、隆起程度和颜色1、原理：分解尿素的细菌合成的、原理：分解尿素的细菌合成的脲酶脲酶将尿素分解为氮、使培养将尿素分解为氮、使培养基的基的碱性增强碱性增强。2、方法：在以、方法：在以尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源的培养基中加入的培养基中加入酚红酚红指示剂培养指示剂培养细菌，若指示剂细菌，若指示剂变红变红，初步鉴定该种细菌能够分解尿素。，初步鉴定该种细菌能够分解尿素。三三. .结果分析与评价结果分析与评价内容内容现象现象结论结论判断有无杂菌污判断有无杂菌污染染选择培养基的筛选择培养基的筛选作用选作用样品的稀释操作样品的稀释操作重复组的结果重复组的结果对照的培养皿中无菌对照的培养皿中无菌落生长落生长菌落形态多样，菌落菌落形态多样，菌落数偏高数偏高培养基灭菌彻底培养基灭菌彻底培养基中混入其它杂菌培养基中混入其它杂