酵素(蛋白质)活性测定

1、實驗二 酵素(蛋白質)活性測定一、實驗目的：1. 學習如何培養微生物的原理2. 掌握酵素(蛋白質)活性測定的操作方法二、實驗原理： 電泳技術在定大分子特徵及分析其純度方面已成基本工具。此法基於這事實，即 DNA，RNA及蛋白質等分子具有電荷，於電場中可以移動。早期的電泳在蔗糖溶液中進行，但此法笨重設備又貴而限制其適用性。以澱粉膠取代蔗糖做支持媒體與抗對流劑增加了電泳在生物問題上的應用，但直到丙烯醯胺膠的好處被挖掘後此法才蓬勃發展。 蛋白質因其所具酸性(glutamic及aspartic acid)與鹼性(lysine及arginine)胺基酸而具電荷。整個分子也只顯示其淨電荷而已。若一具純電荷

2、q的分子置於電場，作用於其上的力F的大小，要視分子所攜電荷與其間電場強度多少而定。以數學法表示其中 E是電極間位差，d是距離；E/d 通常稱場強度。在真空之下分子會加速向著電荷，最後撞擊之。在溶液則不如此，因電場拉力被加速分子與溶液間的拖力或摩擦力抵抗。拖力大小要視分子大小與形狀及其間媒介黏性而定，故得Stokes方程式：其中 r為圓形分子的拖力，h為溶液黏度，v為分子移動的速度。由上式可得知分子移動速度v與電場強度及分子上電荷成正比但與其自身大小和溶液黏度成反比。 電泳只需兩件儀器：(1)直流電源與(2)緩衝劑容器(貯池)系。此系含上下緩衝劑貯池以供含聚丙烯醯胺膠的管子懸於其間。注意二容器間

3、的電接通僅經過丙烯醯胺而已。 一組大分子(如蛋白質)的電泳分離，是將高密度成分，用來防止樣本與上層容器緩衝劑(與丙烯醯胺膠表面接觸)相混合。在電泳常用的pH 9下，大部分蛋白質呈負電性，因陽極在下容器，等電一開，蛋白質向正電荷的陽極移動。通常樣品中有追蹤染料如溴酚藍做為參考。此種有色物質動得比任何大分子都快。故當電泳繼續之中僅有染色抵達管底你才可以合理地確定所有大分子仍在膠內。若分子的分開移動甚慢就可能要測定染料穿越管子的時間，再繼續電泳分離達數倍於此時間。至於幾倍要看欲分離分子而定，只能以試誤法進行。 蛋白質在丙烯醯胺膠中的移動為其淨電荷差異與大小的函數。理論上來說，兩蛋白質若其大小的差異為

4、電荷差異所補償則應以相同速率移向陽極。因此丙烯醯胺膠電泳若如前所述使用一種孔洞大小者，無法獲得分子的分子量方面資料。以下將敘述使用多種孔洞大小的技術。電泳技術的第二個限制是在膠上觀測得的物種數目方面。緊密結合(但非共價性地)複分子在電泳過程中常不能分開。故電泳中出現的蛋白質或RNA區帶數僅能代表實存之中數目的最低可能。為了克服這些問題，Shapiro等人試著將一種陰離子除垢劑硫酸十二酯鈉(SDS)加入後分離蛋白質混合物。他們初步努力的結果促使Osborn添加SDS來測定約40種蛋白質的游動性。發現實驗中這些蛋白質的游動與SDS已知可與蛋白質厭水區結合，而將它們大都以成分亞單位的方式分開。若一蛋

5、白質的成分亞單位為雙硫鍵連結，此鍵可在電泳前以SDS及b-巰基乙醇(b-mercapto ethanol)加熱打斷，還原成巰基團(SH)。這些基團再用適當的烷化劑遮斷以防止雙硫鍵復原。雖說分子量12000與70000 Da之間的蛋白質游動較宜，卻也有的曲線見於游動性對蛋白質分子量在40000至200000 Da的對數的圖形中。此無疑為研究者使用減量的交聯劑N,N-methylene-bis(acrylamide)。在SDS-丙烯醯胺膠電泳(SDS-PAGE)方法中，用在蛋白質分子量測定時要將三或四種分子量高或低於未知物的標準蛋白質(Protein Marker)拿來同時做，以此法括住未知蛋白質

6、產生了標準的直線圖，而未知樣品適當地列在其中以測知其分子量。SDS-PAGE是PAGE的一種特殊型式，SDS是帶負電荷的陰離子去污劑。用SDS-PAGE測定蛋白質分子量時，蛋白質需經樣品溶解液處理，在樣品溶解液中含有巰基乙醇及SDS，各種蛋白質樣品在巰基乙醇作用下，還原成單鏈，再進一步與SDS結合形成帶大量負電荷的SDS-蛋白質複合物。因此各種蛋白質分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分離。SDS-PAGE有連續體系及不連續系兩種，這兩種體系有各自的樣品溶解液及緩衝液，但加樣方式，電泳過程及固定、染色與脫色方法完成相同。電泳技術的廣泛應用已需要發展一種方法來用在看見大分子在丙烯醯胺膠

7、上分離，方法如下：1. Coomassie 亮藍染色 最常用的蛋白質染料是Coomassie 亮藍。此染料由於更大的敏感度(尤其有SDS存在時)而取代了廣用的醯胺黑。此法廣用的變化是同時染色與固定蛋白質。可在1.25g Coomassie 藍溶於454mL 50%甲醇與46mL冰醋酸混合液中將膠浸泡2至10小時。使用之前要很小心地過濾染液(用 Whatmann No.1或同級濾紙)。脫色法是重複地以含冰醋酸、甲醇及水的溶液沖洗膠。2. 螢光染色技術 由於藉Coomassie 藍染色法看見蛋白質需耗時甚多，故有更快更敏感的蛋白質探視法的找尋。有兩個方法很符合此目的： (1).第一個也是最敏感的是

8、螢胺的使用。此不螢光分子針對初級胺反應而產生螢光性的添加產物，染色可在蛋白質用SDS膠分離之前或之後做。 (2).第二個螢光法雖較不敏感，卻也方便。三、實驗儀器： 1. 夾心式垂直板電泳槽凝膠模(135×100×1.5mm)2. 直流穩壓電源(電壓 300600V，電流50100mA)3. 吸量管(1，5，10mL)4. 燒杯(25，50，100mL)5. 細長頭的滴管6. 1mL注射器及6號長針頭7. 微量注射器(10mL或50mL)8. 水泵或油泵9. 真空乾燥器10. 大培養皿(120160mm)四、實驗藥品及試劑：1. 分子量測定標準蛋白質目前國內外均有廠商生產低分

9、子量及高分子量標準蛋白質成套試劑盒，用於SDS-PAGE測定未知蛋白質分子量。(1).高分子量標準蛋白質試劑盒(Pharmacia公司產品)蛋白質名稱分子量來源甲狀腺球蛋白669000豬甲狀腺鐵蛋白440000馬肺過氧化氫酵素232000牛肝乳酸脫氫酵素140000牛心血清白蛋白67000牛血清(2).低分子量標準蛋白質試劑盒，上海生物化學研究所東風生化試劑廠生產。蛋白質名稱分子量備註磷解酵素94000牛血清白蛋白67000肌動蛋白43000碳酸酐酵素30000煙草花葉病毒外殼蛋白17500每種蛋白質含量為40mg。同時加入200ml樣品溶解，經處理後，上樣10ml(2mg)就能顯示出清晰的條

10、帶。 (3).自己配製低分子量或高分子量標準蛋白質混合試劑。如買不到標準蛋白質試劑盒時，可參考常用的標準蛋白質及其分子量表，從中選擇3-5種蛋白質，如馬心細胞色素c (MW 12500)、牛胰胰凝乳蛋白原A(MW25000)、豬胃胃蛋白酵素(MW35000)、雞白蛋白(MW43000)、牛血清白蛋白(MW 67000)等蛋白質，按照每種蛋白質0.51mg/mL樣品溶解液配製。可配製成單一蛋白質標準液，也可配成混合標準液。(1).0.2M pH 7.2 磷酸鹽緩衝液： 稱取磷酸二氫鈉(AR) Na2HPO4.2H2O 25.63g 或Na2HPO4.12H2O 51.58g，再稱取磷酸二氫鈉(A

11、R) NaH2PO4.H2O 7.73g 或NaH2PO4.2H2O 8.74g，溶於重蒸餾水中並定容至1000mL。(2).樣品溶解液：0.01M pH 7.2 磷酸鹽緩衝液，內含1% SDS、1% 巰基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚藍。用來溶解標準蛋白質及待測固體蛋白質樣品。配製方法如下表SDS巰基乙醇甘油溴酚藍緩衝液加重蒸餾水至最後總體積為100mg1mL2mg10mL 如樣品為液體，則應用濃一倍的樣品溶解液，然後等體積混合。 (3).凝膠貯液： 稱 Acr 30g， Bis 0.8g，加重蒸餾水至100mL，過濾後置棕色瓶，4貯存可用12個月。 (4).凝膠緩衝液： 稱S

12、DS 0.2g，加0.2M PH 7.2 磷酸鹽緩衝液至100mL。4貯存，用前稍加溫使SDS溶解。 (5).1% TEMED： 稱 TEMED 1mL，加重蒸餾水至100mL，置棕色瓶內，4貯存。 (6).10% 過硫酸銨(AP)： 稱 AP 1g，加重蒸餾水至10mL，此液應每周新配，置棕色瓶內，4貯存。 (7).電極緩衝液(0.1% SDS，0.1M PH 7.2 磷酸鹽緩衝液)： 稱SDS 1g，加500mL 0.2M PH 7.2 磷酸鹽緩衝液，再用重蒸餾水定容至1000mL。 (8).1%瓊脂醣： 稱瓊脂醣 1g，加100mL上述電極緩衝液使其溶解， 4貯存。3.不連續體系SDS-

13、PAGE 有關試劑 (1).10%(W/V)SDS溶液： 稱SDS 5g，加重蒸餾水至50mL，微熱使其溶解，置試劑瓶中，4貯存。SDS在低溫易析出結晶，用前微熱，使其完全溶解。 (2).1% TEMED(V/V)： 稱 TEMED 1mL，加重蒸餾水至100mL，置棕色瓶內，4貯存。 (3).10% 過硫酸銨(AP)(W/V)： 稱 AP 1g，加重蒸餾水至10mL，此液應每周新配，置棕色瓶內，4貯存。 (4).樣品溶解液： 內含1% SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍，0.01M PH 8.0 Tris-HCl緩衝液。- 先配製0.05M PH 8.0 Tris

14、-HCl 緩衝液： 稱Tris 0.6g，加入50mL 重蒸餾水，再加入約3mL 1M HCl，調pH 至8.0，最後用重蒸餾水定容至100mL。按下表配製樣品溶解液。SDS巰基乙醇蔗糖溴酚藍0. 05MTris-HCl加重蒸餾水至最後總體積為100mg4g2mg2mL10mL 如樣品為液體，則應用濃一倍的樣品溶解液，然後等體積混合。(5).凝膠貯液：- 30% 分離膠貯液：配製方法與連續體系相同。稱 Acr 30g， Bis 0.8g，溶於重蒸餾水中，最後定容至100mL，過濾後置棕色瓶中，4貯存。- 10% 濃縮膠貯液：稱 Acr 10g， Bis 0.5g，溶於重蒸餾水中，最後定容至10

15、0mL，過濾後置棕色瓶中，4貯存。(6).凝膠緩衝液：- 分離膠緩衝液(3.0M PH 8.9 Tris-HCl緩衝液)：稱 Tris 36.3g， 加少許重蒸餾水使其溶解，再加1M HCl約48mL，調PH至8.9，最後加重蒸餾水定容至100mL，4貯存。- 濃縮膠緩衝液(0.5M PH 6.7 Tris-HCl緩衝液)：稱 Tris 6.0g， 加少許重蒸餾水使其溶解，再加1M HCl約48mL，調PH至6.7，最後加重蒸餾水定容至100mL，4貯存。(7).電極緩衝液(內含0.1% SDS，0.05M Tris-0.384M甘胺酸緩衝液 PH 8.3)：稱 Tris 6.0g，甘胺酸28

16、.8g，SDS 1g，加重蒸餾水使其溶解，定容至1000mL。 (8).1%瓊脂醣： 稱瓊脂醣 1g，加100mL上述電極緩衝液使其溶解，4貯存。4.固定液： 取50%甲醇454mL，冰醋酸46mL混勻。5.染色液： 秤考馬斯亮藍 R250 0.125g，加上述固定液250mL，過濾後應用。6.脫色液：冰醋酸75mL，甲醇50mL，加重蒸餾水定容至1000mL。五、實驗步驟： (一)、實驗步驟(一)：1. 安裝夾心式垂直板電泳槽 用細頭長滴管吸取已熔化的1%瓊脂醣溶液，封住長玻璃板下端與矽膠模間的縫隙。加瓊脂醣溶液時，應防止氣泡進入。瓊脂醣溶液用連續體系或不連續體系電極緩衝液配製。2. 配膠及

17、凝膠板的製備 (1).配膠 根據所測蛋白質分子量範圍，選擇適宜的分離膠濃度。由於SDS-PAGE有連續系統及不連續系統兩種，兩者間有不同的緩衝系統，因而有不同的配製方法，如下表表1 SDS-不連續體系凝膠配製試劑名稱配製20mL不同濃度分離膠所需各種試劑用量/mL配製10mL濃縮膠所需試劑用量5%7.5%10%15%3%分離膠貯液30%Acr-0.8%Bis-分離膠緩衝液PH 8.9 Tris-HCl-濃縮膠貯液10%Acr-0.5%Bis-濃縮膠緩衝液PH 6.7 Tris-HCl-10% SDS1% TEMED重蒸餾水混勻後，置真空乾燥器中，抽氣10min10% AP電極緩衝液為PH 8.

18、3 Tris-甘胺酸緩衝液，內容0.1% SDS表2 SDS-連續體系凝膠配製試劑名稱配製20mL不同濃度分離膠所需各種試劑用量/mL5%7.5%10%凝膠貯液30%Acr-0.8%Bis0.2% SDS1% TEMED重蒸餾水混勻後，置真空乾燥器中，抽氣10min10% AP電極緩衝液為0.1M PH 7.2 磷酸緩衝液，內容0.1% SDS (2).凝膠板的製備.SDS-不連續體系凝膠板的製備- 分離膠的製備： 依表1配製20mL 10% PAA，混合均勻後用細長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內，約8cm高，用1mL注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約34mm高，以進行水

19、封。約30min後，凝膠與水封層間出現折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多餘水分。- 濃縮膠的製備： 依表1配製10mL 3% PAA，混合均勻後用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽槽板插入濃縮膠內，約30min後凝膠聚合，再放置2030min，使凝膠“老化”。小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多餘的水分，將PH 8.3 Tris-甘胺酸緩衝液倒入上、下貯槽中，應沒過短板約0.5cm以上，即可準備加樣。.SDS-連續體系凝膠板的製備依表2配製20mL 所需濃度的 PAA，用細長頭滴管將分離膠

20、混合液加到兩片玻璃板的縫隙內直至距離短玻璃板上緣0.5 cm處，插入樣品槽模板。為防止滲漏，可在上、下電極槽中加入蒸餾水，但不能超過短板，以防凝膠被稀釋，約30min後凝膠聚合，再放置2030min，倒去上、下電極中的蒸餾水，小心拔去梳形樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多餘的水分，注意不要弄破凹形加樣槽的底面，倒入電極緩衝液即可進行預電泳或準備加樣品。 (1).樣品的處理根據分子量標準蛋白質試劑盒的要求加樣品溶解液，自己配製標準及未知樣品，按0.51mg/mL樣品溶解液，溶解後，將其轉移到帶塞小離心管中，輕輕蓋上蓋子(不要塞緊，以免加熱時迸出)，在100沸水浴中保溫3min，取出冷卻後加樣

21、。如處理好的樣品暫時不用，可放在-20冰箱保存較長時間，使用前在100沸水中加熱3min，以除去亞穩態聚合。 (2).加樣一般每個凹形樣品槽內，只加一種樣品或已知分子量的混合標準蛋白質，加樣體積要根據凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為1015ml(即210mg蛋白質)。如樣品較稀，加樣體積可達100ml。如樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除。加樣品時，將微量注射器的針頭通過電極緩衝液伸入加樣槽內，儘量接近底部，輕輕推動微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。由於樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶液會自動沈降在凝膠表面形成樣品層。 分離膠聚合後是否進行預電泳則應根據需要而定，

22、SDS連續系統預電泳採用30mA，60120min。 (1).連續系統在電極槽中倒入0.1% SDS PH 7.2、0.1M磷酸鹽緩衝液，連接電泳儀與電泳槽，上槽接負極，下槽接正極。打開電源，將電流調至20mA，待樣品進入分離膠後，將電流調至50mA，待染料前沿遷移至距矽橡膠框底邊11.5cm處，停止電泳，一般需56小時。 (2).不連續系統在電極槽中倒入pH 8.3 Tris-HCl電極緩衝液，內含0.1% SDS 即可進行電泳。在製備濃縮膠後，不能進行預電泳，因預電泳會破壞pH環境，如需預電泳只能在分離膠聚合後，並用分離膠緩衝液進行。預電泳後將分離膠面沖洗乾淨，然後才能製備濃縮膠。電泳條件

23、也不同於連續SDS-PAGE。開始時電流為10mA左右，待樣品進入分離膠後，改為2030mA，當染料前沿距矽橡膠框底邊1.5cm時，停止電泳，關閉電源。 電泳結束後，取下凝膠模，卸下矽橡膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為加樣標誌，在兩側澳酚藍染料區帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。將凝膠板放在大培養皿內，加入固定液，固定過夜。 將染色液倒入培養皿中，染色1hr左右，用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到蛋白質區帶清晰，即可計算相對遷移率。將大培養皿放在一張坐標紙上，量出加樣端距細銅絲間的距離(cm)以及各蛋白質樣品區帶中心與加樣端的距離(cm)，如圖所示。按下式計算相對遷

24、移率mR以標準蛋白質的相對遷移率為橫座標，標準蛋白質分子量為縱座標在半對數坐標紙上作圖，可得一條標準曲線。根據未知蛋白質樣品相對遷移率可直接在標準曲線上查出其分子量。(二)、實驗步驟(二)：蛋白質電泳-1菌液(100uL) + LB(100mL) + Amp(100uL) + IPTG(100uL)(1).菌液活化： j.由-80取出菌液之冷凍tube，置於冰塊中溶解。註：不可置於空氣中溶解，可能會造成菌液急速解凍，而影響菌體的生存k.配製LB ：LB Media 1升中含有- 10g NaCl- 10g Tryptone- 5g Yeast Extract-l.將解凍溶解的菌液100uL 加

25、入裝有100mL LB的250mL錐形瓶中m.每個錐形瓶再加入 0.5% Ampiccilin 溶液 100uL 及 0.5% IPTG溶液 100uLn.置於37的水浴振盪器培養16小時下培養16小時蛋白質電泳-21.養菌：菌液(100uL) + LB(100mL) + Amp(100uL) + IPTG(100uL)(1).菌液活化： j.由-80取出菌液之冷凍tube，置於冰塊中溶解。註：不可置於空氣中溶解，可能會造成菌液急速解凍，而影響菌體的生存k.配製LB ：LB Media 1升中含有- 10g NaCl- 10g Tryptone- 5g Yeast Extract-l.將解凍溶

26、解的菌液100uL 加入裝有100mL LB的250mL錐形瓶中m.每個錐形瓶再加入 0.5% Ampiccilin 溶液 100uL 及 0.5% IPTG溶液 100uLn.置於37的水浴振盪器培養20小時37下培養20小時3.離心，上層液不要，取沈澱物。磷酸緩衝液(Pi buffer)溶解沈澱物 用玻棒溶解沈澱物5.超音波震破菌體若酵素為胞外酵素，則不需此程序；若酵素為胞內酵素，則需此程序將沈澱物震破，以能取出胞內酵素6.震破完後，離心，取上層液 而下層則滅菌後丟棄7.上層液，先測活性(1).活性測試法：j.取800uL上層液加200uL 膠狀chitink.加熱37 維持 30 min

27、l.再加入200uL DNS 溶液，在95反應 10minm.觀察是否有顏色變化，若有的話，表示此上層液中含有此酵素 (1).利用5mL SP Column 或 Q column 若2個串聯 (2).若取1mL的菌液，則再加入45mL的Pi buffer若2個串聯，若取1mL的菌液，則再加入910mL的Pi buffer(4).為了不必要的浪費，利用1.5mL的tube收集流出來的液體，可再測試酵素活性，以決定那些tube要用來跑蛋白質電泳(SDS-PAGE)9.跑蛋白質電泳(SDS-PAGE) (1).gel之配製.玻璃置入組合架上，螺絲對角鎖緊.裝入支撐架上，螺絲向內，有一響聲.測試是否有

28、漏水，水裝至小玻璃頂端，若沒有漏水，則將水倒掉，再用拭鏡紙將水吸乾。.依配方配製好running gel後，倒入大小玻璃之夾縫中，液位約在組合架凹洞的底端。.再加入n-butanol用以壓平 gel的液面.待gel凝固後，則倒掉 n-butanol後，可用水沖洗，再用拭鏡紙吸乾gel之液面水分.將配製好的stacking gel倒入大小玻璃的夾縫中(不能有氣泡)TEMED最後加入，再立即倒入，否則stacking gel很容易凝固.立刻置入齒梳，愈接近running gel愈好。.凝固後(可用烘箱)，取出組合架，置入電泳槽中.槽中需放有4X running buffer.將置入槽中之組合架中的

29、gel之齒狀凹洞中，用注射筒吸取running buffer清洗每個齒狀凹洞。.一切就緒後，開始注入處理過的sample及markerA.各管取 30uL sample 置入 1.5mL tube 中，再加入 5uL 之 5X sample buffer C.取 5uL 之 protein marker D.各管置入dry bath 95 2min E.取出，預備注入膠片之溝槽中 註：marker在注入溝槽時，可能因加熱過程中損失，可加入running buffer稀釋，再注入溝槽中。.注射完後，將組合架之電極蓋上，紅-紅；黑-黑。Power supply之使用：A. 開powerB. 按en

30、terC. 按memoryD. 按1E. 按1F. 按enterG. 按start.按完後，即可開始進行 SDS-PAGE.SDS-PAGE 執行完，由兩片玻璃間拆下gel，要小心，盡量不要使gel破掉。.將 gel (此時沒有band)置入含有 stain solution的盤子中，約1小時的震盪搖晃。.將stain solution回收，再倒入destain solution於盤子中，震盪搖晃一段時間，觀察是否有band產生，若沒有則再換掉destain solution繼續，直至有band產生，即可停止。.可利用膠片觀察箱，估算band之分子量。六、注意事項：1. SDS純度：在SDS-PAGE中，需高純度的SDS，市售化學純SDS需再結晶一次或兩次方可使用。再結