补阳还五汤对老龄大鼠脑缺血再灌注海马齿状回细胞增殖分化的影响

1、补阳还五汤对老龄大鼠脑缺血再灌注海马齿状回细胞增殖分化的影响         10-09-11 14:50:00     编辑：studa20                        作者：高剑峰 吕风华 王晓辉 【摘要】 

2、 目的 从海马齿状回(DG)细胞增殖和分化的变化揭示补阳还五汤(BHD)抗老年脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法 采用大脑中动脉闭塞(MCAO)方法复制脑缺血动物模型，免疫组化方法检测观察DG的5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、神经元核抗原(NeuN)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数，观察脑缺血I/R 1、3、7、14、21 d大鼠神经症状积分、脑组织含水量、病理变化、海马齿状回细胞增殖、分化的变化。结果 模型组脑组织含水量(I/R 1、3、7 d)、神经症状积分(各时间点)、BrdU阳性细胞(各时间点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞(各时间点)、BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R 7、

3、14、21 d)数目均高于假手术组;BHD组神经症状积分、脑组织含水量(I/R 3、7、14 d)低于模型组，BrdU阳性细胞(各时间点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞数目(I/R 3、7、14、21 d)高于模型组,BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R 3、7、14 d)变化相反;BHD组神经症状积分(I/R 7、14 d)低于尼莫地平组，BrdU阳性细胞(I/R 7 d、I/R 14 d)、BrdU/NeuN双标阳性细胞(I/R 7 d、I/R 14、21 d)数目高于尼莫地平组。结论 脑缺血可激活大鼠DG神经干细胞增殖;BHD抗脑缺血再灌注损伤的机制与其促进DG区神经干细胞增殖和分化

4、有关。 【关键词】  补阳还五汤;老年;脑缺血再灌注;神经干细胞;增殖;分化;大鼠脑缺血再灌注可激活脑内神经干细胞发生增殖、迁移1。以往缺血性脑血管疾病的实验研究多忽视脑血管疾病中增龄因素的重要性,致使青年动物的实验研究结果与临床有较大差距，有关老龄大鼠神经再生特点鲜见报道。补阳还五汤(BHD)治疗脑梗死具有明显效果2，机制可能与其改善微循环和拮抗血栓形成及细胞凋亡有关3，4。本研究以老龄大鼠为研究对象,从海马齿状回细胞增殖和分化的变化等方面揭示补阳还五汤拮抗老年脑缺血再灌注损伤机制。1 材料与方法1.1 实验动物和药剂 SD雄性2021月龄大鼠96只(450600 g，动物合格证号

5、：医动字第410117号，由河南省实验动物中心提供)。5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、兔抗大鼠BrdU、兔抗大鼠神经元核抗原(NeuN)、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(均由博士德生物工程有限公司提供);尼莫地平片(批号：0312079;规格：20 mg/片由山东新华制药股份有限公司提供);BHD按医林改错原方所载的药方比例，按每钱3 g换算(生黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，地龙、桃仁、红花、川芎各3 g，药材购自河南中医学院附属门诊部并经鉴定)，煎两次，40 min/次，合并后浓缩为含生药2 g/ml,4冷藏备用。1.2 动物分组、模型制备及BrdU标记 采用改良的Beder

6、son等5法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。设假手术组、模型组(根据缺血及再灌注时间不同分为缺血3 h，再灌注1、3、7、14 d)、尼莫地平组(6 mg·kg-1·d-1)、BHD组(13 g·kg-1·d-1)，每组每个时间点为6只大鼠,造模前5 d开始灌胃给药，造模前2 h加灌一次，假手术组和模型组灌生理盐水。各组均于术后4 h腹腔注射10 g/L BrdU(50 mg/kg,1次/d)。4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，脱水固定，石蜡包埋切片(免疫组化、光镜病理)。1.3 观察指标及方法1.3.1 神经功能障碍评分 参考吴俊芳6提出的8个等级评分标准，

7、各组各时间点动物均进行神经功能障碍评分。1.3.2 脑组织含水量 各组各时间点动物均断头取脑组织，标本用分析天平分别测定其湿重及在电热恒温干燥箱中100干燥48 h后的干重，以计算含水量。公式如下：含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。余脑组织脱水固定，石蜡包埋切片(光镜病理、免疫组化)。1.3.3 病理观察 各组各时间点动物均常规HE染色，光镜下进行病理观察。2.5%戊二醛溶液、1%锇酸固定,常规制作超薄切片,经醋酸铀及柠檬酸铅双染色后,透射电镜下观察神经细胞、胶质细胞和毛细血管等超微结构。1.3.4 BrdU、NeuN和GFAP测定 BrdU阳性细胞采用免疫组化方法测定、Brd

8、U/NeuN和BrdU/GFAP采用双标记染色,全自动彩色图像处理系统进行图像分析，各组各时间点每只大鼠随机选取5张非连续的脑片，在×400镜下，每张切片取缺血侧的DG个3个视野，计数BrdU阳性细胞数;双标结果每张切片选取10个视野，计数BrdU阳性细胞及BrdU/NeuN或BrdU/GFAP双标细胞，计算双标细胞阳性率。1.4 统计学处理 应用SPSS10.0软件包进行统计分析，采用方差分析统计处理，数据均以x±s表示。2 结 果2.1 病理观察 老龄模型组(I/R 1 d、I/R 3 d)可见神经元、神经胶质细胞肿胀，排列紊乱，出现典型的梗死灶，神经元数目减少。血管周

9、围高度水肿、结构欠清晰，炎性细胞浸润明显，形成“血管套”。BHD组可见神经元、神经胶质细胞排列轻度紊乱，部分细胞出现细胞核固缩、深染及肿胀。血管轻度扩张水肿，部分血管受压变形，管周围有炎性细胞浸润,细胞间隙轻度水肿。与同时间点模型组比较病理损伤均减轻，该药物可以明显减轻脑缺血再灌注损伤。2.2 电镜观察 模型组3 h后神经元、胶质细胞胞质出现水肿，线粒体水肿，嵴和膜消失，内质网脱颗粒，染色质浓缩及边缘聚集。3 d超微结构破坏达到最严重，胞质、胞核高度水肿，线粒体水肿，嵴模糊、消失。714 d细胞超微结构破坏略减轻。尼莫地平组14 d神经元、胶质细胞、血管内皮细胞超微结构较模型组病理变化明显减轻,仅见线粒体嵴排列轻度紊乱，粗面内质网轻度脱颗粒，可见大量线粒体，线粒体周围轻度水肿。BHD组3 d以后脑细胞的超微结构病理变化明显减轻,胞质中可见脂褐素，线粒体仅有轻度水肿，嵴底部分消失，膜部分消失，粗面内质网正常，其余细胞器正常，14 d观察细胞质、胞核、细