聚乙二醇修饰的胆固醇酯酶在高密度脂蛋白胆固醇均相测定中的作用

1、聚乙二醇修饰的胆固醇酯酶在高密度脂蛋白胆固醇均相测定中的作用                        【摘要】  目的：对胆固醇酯酶进行修饰，评价修饰酶的反应选择性。方法：采用各种聚乙二醇修饰剂对胆固醇酯酶进行修饰从而获得一系列修饰酶，然后研究这些修饰酶在高密度脂蛋白胆固醇的临床检验中的作用。结果：经双臂聚乙二醇修饰剂修饰的酶比用其他修饰剂修

2、饰的酶具有更好的热稳定性和更高的酶活性，且表现出了较高的对高密度脂蛋白胆固醇的反应选择性。结论：表面活性剂对高密度脂蛋白的选择性解离作用非常重要，这有助于修饰酶发挥其对高密度脂蛋白胆固醇的反应选择性。 【关键词】  聚乙二醇修饰酶 胆固醇酯酶 高密度脂蛋白 解离剂的选择性    众多流行病学与临床研究证实，动脉粥样硬化（AS）、冠心病（CHD）的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）水平呈负相关，而与低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）水平呈正相关。快速准确地测定血清中的HDLC与LDLC水平对临床诊断意义重大13。高密度脂蛋白胆固醇均相测定法（HDLC

3、homogeneous methods）通称直接法（direct method），由于样品不需预处理，可用自动分析仪检测，适合于大规模流行病学调查及工作量大的实验室使用，具有标本用量少、快速、简便、精密度高等优点4。Sugiuchi等5研制出的聚乙二醇修饰酶法（PEGME法）测定HDLC是一种重要的均相测定方法，具有线性关系好、抗干扰能力高、特异性好等优点 67，现已广泛用于临床检验。该方法利用胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶经过PEG6000修饰后而引起酶的变构，变构酶对脂蛋白的大小和（或）电荷具有选择性，其反应选择性依次为高密度脂蛋白(HDL)>乳糜微粒（CM）>极低密度脂蛋白（VLD

4、L）>低密度脂蛋白（LDL）,从而达到检测HDLC的目的5。本研究借鉴目前流行的蛋白质聚乙二醇化学修饰技术89，首先合成了一系列聚乙二醇类修饰剂，然后对胆固醇酯酶进行修饰并获得各种修饰酶，研究这些修饰酶的酶学性质，评价各种不同结构的修饰酶对高、低密度脂蛋白的反应选择性。    1  材料与方法    1.1  试剂与仪器    胆固醇酯酶（CHER，190 U·mg-1）购于日本Asahi kasei公司；胆固醇氧化酶（CHOD，24 U·mg-1）购于日本T

5、oyobo公司;辣根过氧化物酶（POD，250 U·mg-1）购于华美生物工程公司;4氨基安替比林(4AA)、N(2羟基3丙磺酰基)3,5二甲基苯胺钠盐(HDAOS)、胆固醇乙酸酯、2,4,6三硝基苯磺酸钠（TNBS）、单甲氧基聚乙二醇(mPEG，相对分子质量2000、5000）、聚乙二醇(PEG，相对分子质量4000、6000、20000）均购于Sigma公司；TritonX100购于上海伯奥生物科技公司(美国进口分装)；硫酸环糊精（SCD）自制10；超速离心所得HDL及LDL纯品由南京军区总医院捐赠。    紫外可见分光光度计（Cary 100 Bi

6、o UV Spectrophotometry,Varian），红外光谱仪(TENSOR 27,Bruker)，核磁共振仪（300 MHz,Bruker），pH计（PB10,Sartorius）。    按照Leonard等1112所述方法合成修饰剂，用N羟基琥珀酰胺和二环己基碳二亚胺活化，合成mPEG2000NHS、PEG4000NHS、mPEG5000NHS、PEG6000NHS和PEG20000NHS单臂聚乙二醇修饰剂，修饰剂结构如图1A所示。按照文献1314介绍的方法合成2mPEG2000LysNHS、mPEG5000+ 2000LysNHS以及2mPEG5

7、000LysNHS双臂聚乙二醇修饰剂，修饰剂结构如图1B所示。    1.2  胆固醇酯酶的修饰    称取一定比例的修饰剂及原酶，分别溶解在0.2 ml磷酸缓冲液（pH 9.3,0.1 mol·L-1）中。将修饰剂溶液分3次在20 min内加入原酶试剂中，每次混合均匀，随后放入4  冰箱中过夜。第2天在4 下透析，透析液采用Na2HPO4NaH2PO4 缓冲液（0.1  mol·L-1，pH 8.5）。CHER浓度测定采用紫外双波长法。    1.3&#

8、160; 修饰酶修饰化度的测定    采用TNBS法1516测定修饰酶的修饰化度，原理是利用2，4，63硝基苯磺酸(TNBS)能与蛋白中赖氨酸残基上的氨基进行显色反应，然后用紫外可见分光光度计进行分析。    1.4  修饰酶的活力测定17    原理如图 2所示，CHER将胆固醇乙酸酯水解为游离胆固醇，后者被CHOD氧化成4胆甾烯酮并产生过氧化氢,再经过氧化物酶(POD)催化,与助色剂4氨基安替比林(4AA)和显色剂N(2羟基3丙磺酰基)3,5二甲基苯胺钠盐(HDAOS)作用,生成蓝色醌亚胺色

9、素。醌亚胺的最大吸收在600 nm左右,吸光度值的变化与CHER的活力成正比。    1.4.1  显色剂溶液  0.1 mg POD，5 mg 4AA溶于10 ml TrisHCl 缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）。    1.4.2  底物溶液  称取25 mg胆固醇乙酸酯溶于2 ml Triton X100，加热至完全溶解且溶液澄清，再加入18 ml pH 7.0磷酸缓冲液。    1.4.3  原酶反应液  5 m

10、l TrisHCl 缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）中溶有CHER 0.016 g·L-1,CHOD 0.016 g·L-1,HDAOS 0.75 g·L-1。    1.4.4  修饰酶反应液  5 ml TrisHCl 缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）中溶有PEGCHER 0.016 g·L-1,CHOD 0.016 g·L-1,HDAOS 0.75 g·L-1。    1.4.5  活力测定&

11、#160; 取原酶反应液0.4 ml 37 温育2 min，分别加入底物0.1 ml，37 再温育5 min，加入显色剂0.3 ml，600 nm处测得吸光度A1、A1；修饰酶的活力测定同原酶，测得吸光度A2、A2。（A2-A1）/(A2-A1)即为修饰酶的活力残余。    1.5  修饰酶对HDL反应选择性的评价方法       试剂R1：SCD（1.15 g·L-1）,无水MgSO4（0.2 g·L-1）,HDAOS（0.3 g·L-1）溶于Na2HPO4NaH

12、2PO4 缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）；试剂R2：PEGCHER（1.2 kU·L-1），CHOD（6 kU·L-1），POD（30 kU·L-1）,4AA（0.5 g·L-1）,解离剂（0.01 0.16 kg·L-1），溶于Na2HPO4NaH2PO4 缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）。    检测样品为超速离心所得HDL（1 mg·dl-1）及LDL（1.2 mg·dl-1），所用酶联反应过程见图 3。测定过程为：取0.6 ml R1加入

13、8 l 样品（HDL或LDL），37 温育5 min后600 nm处测吸光度A0，加入0.2 ml R2，37 恒温反应每分钟测1次A600 nm，7 min后停止反应；计算光吸收变化值A。    以表面活性剂Triton X100（0.16 kg·L-1）为强解离剂,使用未修饰胆固醇酯酶（1.2 kU·L-1）时所测得的A作为100%解离HDL/LDL，计算出各种修饰酶对HDL及LDL的解离程度。    1.6  修饰酶的热稳定性    将修饰酶溶液用磷酸钠缓冲溶液（0.0

14、5 mol·L-1，pH 7.0）稀释至0.25 mg·ml-1，于37 恒温培养箱中恒温一定时间，取出后以胆固醇乙酸酯为底物测定酶活力，可以得到相对酶活力与时间的关系。    1.7  酶及修饰酶Km值的测定    米氏常数Km值的测定采用双倒数作图法（LineweaverBurk法）18。    2  结    果    2.1  修饰酶的活性变化    胆固醇酯

15、酶在不同比例的不同结构的修饰剂作用下，其修饰酶的修饰化度有较大的差别，低分子质量的单臂修饰剂（PEG4000或mPEG2000）在较低的比例下就可以取得较高的修饰化度，但双臂修饰剂（2mPEG或mPEG50002000）和高分子质量的PEG20000NHS修饰后的修饰酶修饰化度较低，酶活力损失较少，这可能是由于PEG20000NHS的分子质量较大，而双臂修饰剂的立体构型类似于伞形，它们与酶反应的空间位阻较大，仅仅能与酶分子表面的赖氨酸残基反应，因此反应较难发生，而且修饰化度低往往酶活力损失较小,这与其他研究组关于聚乙二醇修饰蛋白质的研究结果1920一致。我们以双臂的mPEG7000LysNHS

16、和mPEG5000NHS为例进一步研究了修饰剂与酶的质量比、修饰化度和酶活力的关系，结果发现随着加入修饰剂的比例提高，修饰酶的修饰化度随之增加，而修饰酶的活力随之降低。相同质量比的双臂修饰剂与单臂修饰剂相比，单臂修饰剂修饰后的修饰化度比双臂高；而相同修饰化度的修饰酶，经双臂修饰的保存活力明显比经单臂修饰多。见表1、2。表 1  PEG化胆固醇酯酶的活力和其对HDLC 和 LDLC的反应活性注：括号内为酶与PEG类修饰剂的比值；DHDL为HDL的解离度，DLDL为LDL的解离度注：括号内为酶与PEG类修饰剂的比值；DHDL为HDL的解离度，DLDL为LDL的解离度；解离剂为0.16 g

17、·ml-1AEO10    2.2  修饰酶的Km值变化    在本实验条件下测得原酶的Km值(×10-3)为0.586,其余几种修饰酶中仅有CHER2mPEG2000、CHERmPEG7000和CHER2mPEG5000 3种经双臂PEG修饰后的修饰酶的Km较接近于原酶，分别为0.740、0.926和0.830,即能在很大程度上保持修饰酶对底物的亲和力。这可能是因为双臂PEG特殊的结构使得修饰剂分子无法与酶分子活性位点的赖氨酸残基接触，不会影响酶对底物的特异性结合。其余5种修饰酶的Km值均有大幅提高，即

18、表明这几种修饰酶对底物的表观亲和力减小，其中经PEG20000修饰后修饰酶的Km最大(3.3)，可能是因为单臂PEG会与酶活性位点赖氨酸残基结合，影响酶对底物的特异性结合，而双端羟基PEG(包括PEG4000、PEG6000和PEG20000)除此之外可能还会与酶分子发生交联，进而改变酶分子的空间结构，降低了酶对底物的特异性结合能力。                       

19、;          2.3  修饰酶的热稳定性    修饰酶的热稳定性较原酶有所增强，除PEG20000外，其余7种PEG修饰剂修饰胆固醇酯酶后均使其热稳定性略有改善，其中双臂PEG的修饰效果较好。2mPEG2000LysNHS、2mPEG5000Lys和mPEG7000Lys在37 恒温82 h后仍能保持最初活性的27.4%、30.9%和35.5%，而原酶和经PEG20000修饰的酶经相同时间后只能保持最初酶活性的16.4%和16.1%。  

20、  3  讨    论    当不使用表面活性剂解离脂蛋白时，未修饰酶没有表现出对HDLC或LDLC的反应活性，当然修饰酶也没有活性（表1）。当所使用的AEO9（脂肪醇与环氧乙烷缩合物类表面活性剂）对HDL和LDL没有选择性解离作用时，修饰酶也没有表现出选择性，这说明解离剂解离脂蛋白是整个酶联反应的前提，解离剂所表现出的对脂蛋白的选择性解离作用十分重要。事实上，HDLC的直接测定法中的聚阴离子多聚物/表面活性剂（polyanion polymer/detergent,PPD）法21就是利用表面活性剂对HDL的选择性

21、解离作用完成测定工作的，但该方法（PPD法）试剂对HDL的作用相对缓慢且对LDL具有比较明显的非特异性反应（至少不低于10，甚至达到20），所以影响结果的准确性7。因此，我们对市面所售表面活性剂进行了筛选发现，HLB (亲水亲油平衡)值在10 13的非离子表面活性剂能很好地解离脂蛋白，将使其中的胆固醇酯释放出来参与反应。其中以烷基酚与环氧乙烷缩合物类表面活性剂解离速度最快，但无特异性；HLB在12.5 13的脂肪醇与环氧乙烷缩合物类表面活性剂表现出对HDL有一定的选择性解离作用；不同类的表面活性剂解离作用差异很大，且与其加入浓度有很大关系。一般来说随着所加浓度的降低，对HDL与LDL的解离度也

22、呈下降的趋势（胆酸钠除外），但两者的降低速度有差异，这就在一定的浓度区间内形成了选择性。表3显示AEO10（脂肪醇与环氧乙烷缩合物类表面活性剂）在0.001 0.1 g·ml-1时表现出对HDL有一定的选择性解离，而APG（烷基糖苷类）在0.000 2 0.01 g·ml-1时表现出对LDL一定的选择性解离。以AEO10为解离剂对单臂mPEG5000及双臂mPEG5000+2000LysNHS不同修饰化度的修饰酶进行研究，部分结果列入表2。由表2可以看出选用合适的解离剂时，经双臂修饰剂修饰后的胆固醇酯酶在一定的修饰度时可提高对HDL的选择性解离。这说明修饰酶的选择性是建立在

23、解离剂的选择性基础上的，修饰酶可以提高表面活性剂的选择性。双臂修饰剂由于其特殊的枝型尾部结构使其空间位阻加大，只能对胆固醇酯酶的表面赖氨酸进行修饰，所以经其修饰的酶活力损失较单臂少，同时由于其特殊结构经其修饰的胆固醇酯酶所表现出的选择性明显比单臂好,在酶修饰技术上有很好的应用前景。由表4可以看到mPEG5000CHER (修饰度38%)在AEO10质量浓度为0.08 g·ml-1对HDL的选择性最好，但此时的酶活性低于mPEG7000CHER (修饰度27.3%，表2），所以综合考虑在本实验条件下，mPEG7000CHER (修饰度27.3%)在AEO10质量浓度为0.16 g

24、83;ml-1对HDL的选择性为最终优化结果。表 3  表面活性剂浓度对其解离HDL/LDL选择性的影响注：DHDL为HDL的解离度，DLDL为LDL的解离度表 4  AEO10的浓度对PEG化的胆固醇酯酶对HDL/LDL的反应选择性的影响注：DHDL为HDL的解离度，DLDL为LDL的解离度    表面活性剂的选择性形成可能是由于不同脂蛋白膜上的载脂蛋白亲水亲油性质的不同造成的。Sugiuchi等5认为,胆固醇酯酶经过聚乙二醇修饰后由于其接上的亲水长链能识别表面带有亲水性较强的载脂蛋白apoA的HDL。我们认为,也有可能是由于其带的亲水长链使

25、其与脂蛋白隔有一段空间距离，从而只能优先与被表面活性剂破坏的脂蛋白中释放出来的胆固醇酯进行反应，最后促进了表面活性剂的选择性。解离剂才是选择性的提供主体，因为正是解离剂破坏脂蛋白的膜层迫使其中的胆固醇酯被释放出来与胆固醇酯酶进行反应。因此我们认为，聚乙二醇化的胆固醇酯酶与高密度脂蛋白胆固醇的反应可分为2个协同步骤：首先高密度脂蛋白胆固醇被表面活性剂选择性地解离，由于经聚乙二醇化的胆固醇酯酶的亲水性较好，所以富积在高密度脂蛋白胆的周围，从而易于捕获被表面活性剂释放出来的高密度脂蛋白胆固醇酯，然后聚乙二醇化的胆固醇酯酶进一步地选择性地与高密度脂蛋白胆固醇酯作用。Sugiuchi等5 的研究结果没有

26、涉及表面活性剂的作用，使人们容易产生对HDL反应的选择性可完全由修饰酶提供的错误认识。    综上所述，目前修饰酶、解离剂与脂蛋白之间的作用机制尚不清楚，我们认为仍需做进一步的基础理论研究。胆固醇酯酶经各种聚乙二醇修饰剂修饰后表现出了一些性能上的变化。双臂的聚乙二醇修饰剂在保持酶活性，增加酶对HDL的反应选择性及提高酶的热稳定性等方面均优于其他结构的聚乙二醇修饰剂，因此应该深入地开展这方面的应用研究。 【参考文献】  1鄢盛恺.高、低密度脂蛋白胆固醇的匀相测定法及技术要求J.临床检验杂志，2002,20 (6):325328.2LAW M R,WALD N J,THOMPSON S G,et al.By how much and how quickly does reduction in serum cholesterol concentration lower risk of ischaemic heart disease?J.Br Med J，1994,308:367372. 3WILSON P W,ABBOTT R D,CASTEL