脑啡肽对早期反应性胶质增生形态及其神经营养功能的影响

1、脑啡肽对早期反应性胶质增生形态及其神经营养功能的影响    魏光伟朱粹青唐崇仁杜莅娜曹小定吴根诚 【摘要】目的研究脑啡肽对早期反应性胶质细胞形态、增殖及神经营养功能的影响。方法在相差显微镜下观察反应性胶质细胞形态，3H-TdR掺入实验检测反应性胶质细胞增殖，以Griess反应测定亚硝酸盐含量表示一氧化氮(NO)量，原位杂交实验检测生长相关蛋白(growth associated protein,GAP-43)mRNA的表达。结果脑啡肽能促进损伤边缘的胶质细胞向损伤裸露区伸出宽大扁平的突起，增强反应性胶质细胞3H-TdR的掺入(P0.05)，抑制其NO的生

2、成(P0.05)；经脑啡肽处理的反应性胶质细胞能增强神经元GAP-43mRNA的表达(P0.05)。结论脑啡肽增强反应性胶质增生的同时抑制了反应性胶质细胞NO的生成而增强反应性胶质细胞的神经营养功能。 【关键词】脑啡肽反应性胶质增生GAP-43mRNA NO EFFECTS OF ENKEPHALIN ON EARLY REACTIVE GLIOSIS AND ITS NEUROTROPHIC FUNCTION IN VITRO Wei Guangwei,Zhu Cuiqing,Tang Chongren,Du Lina,Cao Xiaoding,Wu Gencheng (State Key

3、Laboratory of Medical Neurobiology,Department of Neurobiology Shanghai Medical University,Shanghai) 【Abstract】Objective To study the effects of methionie-enkephalin(ME) on the morphology,proliferation and neurotrophic function of early reactive glial cells in vitro.Methods Morphology of reactive gli

4、al cells was observed under phase-contrast microscope.Proliferation of reactive glial cells was measured by 3H-TdR uptake.NO concentration was represented by nitrite which was determined by Griess reaction.GAP-43mRNA expression was observed by in situ hybridization.Results ME could enhance the respo

5、nses of glial cells to injury (P0.05),inhibit early reactive glial NO production (P0.05);ME-treated reactive glial cells could improve the expression of neuronal GAP-43mRNA (P0.05).Conclusion Methionine-enkephalin may increase early reactive glial neurotrophic ability through enhancing reactive glio

6、sis and inhibiting reactive glial NO production. 【Key words】 Methionine-enkephalin;Reactive gliosis;GAP-43mRNA;NO 反应性胶质增生是中枢神经损伤和炎性疾病共有的病理现象，主要表现为胶质细胞被激活后增殖、胞体代尝性肥大，并分泌多种神经肽、细胞因子和生长因子等1，参与构成受损部位神经元生存的微环境，对受损部位神经元的存活、突起的再生和神经系统功能的恢复有重要的影响。近年研究表明激活的星形胶质细胞能大量分泌脑啡肽包括甲啡肽(methionine-enkephalin,ME)2，但关于脑啡肽

7、在反应性胶质增生中的作用及意义目前尚不清楚。我们拟采用中枢胶质细胞体外培养划痕损伤外源性加入脑啡肽的方法，观察脑啡肽对反应性胶质细胞形态及增殖的影响，并在反应性胶质细胞-神经元复合培养基础上以GAP-43mRNA的表达为指标观察脑啡肽对反应性胶质细胞神经营养功能的影响。 胶质细胞是中枢神经系统中NO的主要来源之一3，NO的过量表达能通过多种机制造成组织、细胞的损伤，并有报道ME可抑制NO的跨膜释放4。为此，本实验进一步观察了ME对反应性胶质细胞生成NO的影响，以期探讨ME影响反应性胶质细胞神经营养作用的机理。 材料和方法 1.中枢胶质细胞体外培养及划痕损伤 取P2d SD大鼠，无菌条件下剪取皮

8、层，用0.25%的胰蛋白酶制备细胞悬液，以2×105/cm2密度接种于培养板内，在5%CO2、95%空气的CO2培养箱内37孵育。培养约1周后采用Yu5的方法，用消毒移液器头(200l)，在每一培养孔内做“#”字形划痕，更换培养液以除去脱落细胞及碎片，加入新鲜培养液继续培养。 2. 反应性胶质细胞-神经元复合培养 取E16d SD大鼠，无菌条件下剪取皮层，用0.25%的胰蛋白酶制备细胞悬液，以2×104/cm2的密度种植于用多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)处理的盖玻片上，置5% CO2、95%空气的培养箱内孵育。按此密度种植的神经元多呈分散生长。神经元特异性

9、烯醇化酶(neuronal specific elonase,NSE)免疫组织化学证实，4d内神经元的纯度在90%以上。按方法1培养胶质细胞5d，划痕损伤2d后，加入按此方法制备的胚胎脑细胞悬液。 3. 3H-TdR掺入实验 用12孔培养板培养新生大鼠大脑皮层胶质细胞，7d后做划痕损伤，分为生理盐水对照组、ME终浓度分别为10-10、10-8、10-6 mol/L组及终浓度分别为10-8、10-6mol/L的ME(Peninsula,USA)+纳洛酮(naloxone,Nal；Sig,USA)组，同时加入终浓度为0.5mCi/L的3H-TdR，继续培养。24h后吸去培养液，用0.1mol/L

10、NaOH溶液裂解细胞，将裂解液移至玻璃纤维滤膜上，置滤膜于加有5ml闪烁液(0.035%POPOP、0.45% PPO溶于二甲苯)的闪烁杯内，室温放置30min，在液闪计数仪上读取cpm值。 4.GAP-43mRNA原位杂交 新生大鼠大脑皮层胶质细胞培养5d后划痕损伤，分为ME组(终浓度10-10mol/L)和生理盐水组。培养2d后吸除培养液，用新鲜培养液清洗细胞2遍，加入取自E16d大鼠的大脑皮层细胞进行反应性胶质细胞-神经元复合培养。2d后取出培养片用Dig标记RNA探针(第三军医大学组织学胚胎学教研室合成)做GAP-43mRNA原位杂交。方法简述如下：4%多聚甲醛固定5min，蛋白酶K(

11、2mg/L)37消化2min，滴加含GAP-43mRNA探针(10g/L)的杂交液，37杂交2h,DIG免疫组织化学，NBT、BCIP显色。替代对照：用不含探针的杂交液行同步杂交。阳性对照：用已确认阳性的标本行同步杂交。摄片、图像处理，用Q570图像处理系统(Leica,Germany)测量单个阳性细胞的积分光密度(IA)。 5.NO测定(亚硝酸盐重氮化反应法) 新生大鼠大脑皮层细胞培养7d划痕损伤后，分生理盐水对照组、终浓度分别为10-12、10-10、10-8、10-6mol/L的ME组、终浓度分别为10-10、10-8mol/L的ME+Na1组，继续培养18h后吸取培养上清液，同时培养细

12、胞用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，用血球计数板计数每组培养中细胞数目。化学性质极为活跃的NO，释放后很快转变为性质稳定的NO-2，可测定培养上清液中NO-2的含量，间接反映反应性胶质细胞NO生成量。在酸性环境下NO-2与对氨基苯磺酸起加成反应，其加成产物与N-(1-萘)-乙二氨发生反应(Griess重氮化反应)，反应产物在548nm处有吸收峰，具体测量方法如下：用96孔酶标板，每样品分两孔，每孔加0.15ml培养上清液后分别加入等体积的Griess液5%磺胺溶于5%磷酸，0.1%N-(1-萘)-乙二氨，临用前11混匀或等体积的蒸馏水打匀，548nm波长下在酶标仪(BIORAD，USA)上读取吸光度

13、，同时用不同浓度的NaNO2制作标准曲线，将样品的吸光度转换成NO-2的浓度，样品的NO-2的含量用nmol/106细胞表示。      结果 1. 脑啡肽对反应性胶质细胞形态的影响 培养胶质细胞划痕损伤后，在倒置相差显微镜下观察可见损伤边缘细胞形态不规则，有些细胞浆灰暗，呈变性样变，胞膜卷曲、皱缩。损伤后4h即可看到胶质细胞自损伤边缘向损伤裸露区伸出宽大而扁平的突起，损伤后8h、24h邻近损伤区的细胞接触松散，胞浆突起进一步向损伤裸露区延伸，3d后裸露区基本被其覆盖。胶质反应的形态时程变化与Yu5报道基本相符。损伤加药后8h，即可看出与对照组的差异，加

14、药组损伤边缘的细胞向损伤裸露区伸出的胞浆突起更加宽大，24h差别更加明显(图1)，至48h时即基本覆盖损伤裸露区。 图1培养胶质细胞划痕损伤后损伤边缘伸出宽大、扁平的突起A.划痕损伤8h B.划痕损伤并加入ME8h C.划痕损伤24h D.划痕损伤并加入ME24h×200(示划痕损伤边缘,示胞浆突起生长边缘) Fig.1 Growth of widende and flatened cytoplasmic processes toward denuded area after scratching of cultured glia.A,8h after scratching woun

15、d;B,8h after scraching wound and ME-treatment;C,24h after scratching wound;D,24h after scratching wound and ME-treatment ×200(indicates the edge of scratching wound,indicates the growing edge of cytoplasmic processes) 2. 脑啡肽对反应性胶质细胞增殖的影响 3H-TdR掺入实验显示，10-1010-6mol/L的ME均能增加划痕损伤后反应性胶质细胞的3H-TdR掺入，即

16、增加反应性胶质细胞的增殖(P0.05)，但不同剂量间未发现显示性差异。阿片受体拮抗剂Na1能部分反转ME的促反应性胶质细胞增殖作用(图2)。 图2脑啡肽对反应性胶质细胞增殖的影响 Fig.2 Effect of ME on proliferation of reactive glial cells (*P0.05 vs control). 3. 脑啡肽处理的反应性胶质细胞对神经元GAP-43mRNA表达的影响 反应性胶质细胞-神经元复合培养GAP-43mRNA原位杂交后，原来的划痕区在镜下隐约可见，测定损伤区域附近神经元的IA。图像处理结果显示ME处理组单个神经元平均IA为59.74±

17、;9.14，比生理盐水对照组的49.50±7.64明显增加(P0.05，图3)，提示ME能增强反应性胶质细胞的神经营养功能。 图3ME处理的反应性胶质细胞对神经元GAP-43mRNA 表达的影响A.对照组；B.ME处理组×200 Fig. Effect of ME-treated reactive glia on the GAP-43mRNA expression by neurons.A,control group;B,ME-trested group.×200 4. 脑啡肽对反应性胶质细胞NO生成的影响 首先观察了不同浓度的ME对反应性胶质细胞NO生成的影响。

18、结果显示，ME在10-10mol/L这一较低浓度时对NO生成的抑制作用较明显，浓度增高抑制作用反而减弱，阿片受体拮抗剂Na1能部分反转ME的作用(图4)。然后我们又选取10-10mol/L这一有效浓度进一步观察了加入ME不同时间(12、18、24、48h)后反应性胶质细胞生成NO的情况，结果表明，加入ME 18h后开始抑制反应性胶质细胞NO的生成，至48h仍有作用(P0.05),见附表。48h后反应性胶质细胞生长情况较差，细胞数明显减少。 图4脑啡肽对反应性胶质细胞NO生成的影响 Fig.4 Effect of ME on reactive glial NO production (*P0.0

19、5 vs control). 附表ME作用不同时间后对反应性胶质细胞NO生成的抑制作用 Table Time course changes of inhibitory effects of ME on NO production in reactive glia 时程 time(h) 亚硝酸盐量(nmol/106细胞) NO-2(nmol/106 cells) 对照组 control ME处理组 ME-treated group 12 31.28±5.16 24.49±2.96 18 33.55±2.75 25.10±1.22* 24 25.81

20、7;3.18 18.52±1.42* 48 20.10±1.41 15.92±0.90* *与对照组相比差异有显著性意义(P0.05) * P0.05 vs control 讨论 脑啡肽及其受体在体内分布广泛，作用涉及多种病理生理过程。由于在整体动物脑损伤模型上观察脑啡肽对反应性胶质增生的影响受到一定限制，我们采用了胶质细胞体外培养划痕损伤作为研究反应性胶质增生的模型。该模型具有简化影响因素、易控制实验条件、能在某种程度上模拟在体脑损伤的优点5。 本实验观察到脑啡肽能增强反应性胶质细胞的生长及增殖，从细胞形态、增殖两个方面表明脑啡肽具有增强反应性胶质增生的作用，提

21、示脑啡肽在中枢神经损伤早期能通过增强反应性胶质增生为神经元的再生提供生长支架和再生基质。 在脑啡肽促反应性胶质细胞增殖的作用中没有观察到明显的剂量-效应关系，且阿片受体拮抗剂Na1只能部分反转脑啡肽的作用，提示脑啡肽在增强反应性胶质增生作用中可能有阿片受体外作用，文献报道脑啡肽可通过非阿片受体或NMDA受体起作用6，7，这方面还有待于作深入的研究。 脑啡肽能增强早期反应性胶质增生，而早期反应性胶质增生基本上能重现胶质细胞在胚胎发育过程中的神经营养作用8，提示脑啡肽有可能影响到反应性胶质细胞的神经营养功能。GAP-43是一种神经元特异性蛋白，在中枢及外周神经损伤后都伴有其转录和表达的显著增加，它

22、的表达可作为神经生长、再生的指标9。为此，实验中以GAP-43mRNA的表达为指标，观察了脑啡肽对反应性胶质细胞神经营养功能的影响。结果表明，经ME处理的反应性胶质细胞能增加神经元GAP-43mRNA的表达，提示经ME能增强反应性胶质细胞的神经营养作用。 体内外实验均表明，神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞均可生成NO，且可受多种因素调控3。它的过量表达能通过多种机制造成组织、细胞的损伤。实验中我们也观察到阻断胶质细胞NO生成后，神经元存活和突起生长成倍增加。因此，我们进一步观察了ME对反应性胶质细胞NO生成的影响。实验发现浓度为10-1010-6mol/L的ME均能抑制反应性胶质

23、细胞NO的生成。提示ME增强反应性胶质细胞神经营养功能的机制之一可能是抑制其NO的生成。实验观察到ME浓度在10-10、10-8mol/L时，对反应性胶质细胞生成NO的抑制作用比10-6mol/L时要强，有人在脑啡肽促大鼠脾淋巴细胞增殖实验中也观察到ME浓度增高其作用反而减弱11，机理不清。      NO的生成涉及一氧化氮合酶的表达量及活性、NO的释放、合成原料精氨酸的供给等多个环节。文献报道ME能抑制NO的跨膜释放，10-10mol/L的ME对NO释放的抑制效率可达82%4，ME影响反应性胶质细胞NO释放及生成的机理有待进一步的实验研究。 以上结果提

24、示，脑啡肽增强早期反应性胶质增生的同时抑制了反应性胶质细胞NO的生成，增强了胶质细胞的神经营养功能，通过多种机制参与中驱神经损伤的保护和再生。 * 国家教委博士点基金(No.9506197),国家自然科学基金重点资助课题(No.39730510) Department of Neurobiology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China 作者单位:上海医科大学神经生物学教研室，医学神经生物学国家重点实验室，上海200032 参考文献 1Landis DMD.The early reaction on non-neuronal cel

25、ls to brain injury.Annu Rev Neurosci,1994,17:(1)133 2McMillian MK,Hong JS.Regulation of preproenkephalin expression in astrocytes:is there role for glial-derived opioid peptides in reactive gliosis?Crit Rev Neurobiol,1994,9(1):91 3Murphy S,Simmons ML,Agullo L,et al.Synthesis of nitric oxide in CNS glial cells.TINS,1993,16(8):323 4Deliconstantinos G,Villiotou V,Stavrides JC.Met-enkephalin receptor-mediated increase of membrane fluidity modul