猪高热病细菌性病原的分离鉴定及其生物学特性研究

1、猪高热病细菌性病原的分离鉴定及其生物学特性研究    英文题名 Isolation, Identification and Biological Characterization of Bacterial Pathogen in Outbreak of Swie High Fever Disease  关键词 副猪嗜血杆菌; 多杀性巴氏杆菌; 猪胸膜放线杆菌; 猪链球菌; 复合PCR; 英文关键词 Haemophilus parasuis; Pasteurella multocida; Actinobacillus pleuropneumoni

2、ae; Streptococcus suis; multiplex PCR; 中文摘要 猪“高热病”是由多种病原混合感染引起的综合征,针对安徽地区猪群中广泛流行的多病因“高热病”进行细菌性病原的研究对“高热病”的防治具有重要的现实意义。 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)形态学、生长特性相似,临床感染难以区分,本研究根据HPS、Pm、APP的特异性序列,成功建立了复合PCR方法的快速诊断方法,该方法特异性好

3、,可以检测出HPS、Pm、APP最低量分别为60pg、120pg和50 pg的DNA,极大的提高了三种细菌的鉴定速度和效率,同时将该方法应用于病死猪的病料检测,结果显示该方法可用于HPS、Pm、APP的临床监测。 利用常规细菌分离鉴定结合建立的复合PCR方法,从安徽肥东、肥西、淮北、桐城、阜阳、宿州、六安、庐江、宣城、舒城十个地区的具有高热及呼吸系统症状的146头发病或死亡猪中分离细菌67株,分离率为45.89%,其中SS 20株,HPS 12株,Pm 16株,APP 2株,分离率分别为29. 英文摘要 Swine "high fever disease" was caus

4、ed by multiple infection with kinds of pathogens, secondary infection of bacteria usually exacerbates the severity of the disease. So, isolation and identification of bacteria from pigs with“high fever disease”will are favorable for developing effective measure of prevention and control for "hi

5、gh fever disease". A multiplex PCR technology was developed for PCR detection of HPS、Pm、APP with sensitivity of the minimum DNA amount of 60pg、120pg and 50pg. Results demostrated 中文摘要 4-5 Abstract 5 插图和附表清单 8-10 主要符号列表 10-11 文献综述 11-23 1 引言 23-24 2 材料与方法 24-35     2.1 材料 24-26 &#

6、160;       2.1.1 病料来源 24         2.1.2 参考菌株 24         2.1.3 主要培养基 24         2.1.4 主要试剂与溶液配制 24-25         2.1.5 细菌微量生化反应管 25

7、60;       2.1.6 抗生素药敏试验纸片 25-26         2.1.7 引物设计 26         2.1.8 主要仪器 26     2.2 细菌的分离培养与生化鉴定 26-27         2.2.1 培养基的制备 26-27    &#

8、160;    2.2.2 细菌的分离培养 27         2.2.3 生化试验鉴定 27     2.3 HPS、Pm、APP 复合PCR 方法的建立与应用 27-28         2.3.1 细菌DNA 的提取 27         2.3.2 病料中细菌DNA 提取 27    &#

9、160;    2.3.3 PCR 扩增 27-28         2.3.4 复合PCR 反应条件优化方案 28         2.3.5 PCR 产物分析 28         2.3.6 复合PCR 的特异性测定 28         2.3.7 复合PCR 的敏感性 28 &#

10、160;       2.3.8 复合PCR 的临床应用 28     2.4 A 型Pm 的鉴定 28-29         2.4.1 DNA 模板的制备 28-29         2.4.2 A 型Pm 的PCR 鉴定 29     2.5 SS2 的PCR 鉴定 29-30     2.6 分离株H

11、PS 部分生物学特性研究 30-31         2.6.1 HPS 形态多样性 30         2.6.2 HPS 卫星现象 30         2.6.3 HPS 生长曲线的测定 30         2.6.4 HPS 16srRNA 序列测定与分析 30-31    &

12、#160;    2.6.5 HPS 动物感染试验 31     2.7 副猪嗜血杆菌tbpA RFLP 型与序列分析 31-34         2.7.1 tbpA 的扩增 31-32         2.7.2 tbpA-RFLP 型鉴定 32         2.7.3 tbpA 基因的克隆与分析 32-34  

13、;           2.7.3.1 PCR 产物的连接 32-33             2.7.3.2 E.coli DH5感受态细胞的制备 33             2.7.3.3 转化E.coli DH5感受态细胞 33    

14、60;        2.7.3.4 重组质粒的提取及鉴定 33-34             2.7.3.5 重组质粒的PCR 鉴定 34             2.7.3.6 基因序列测定与分析 34     2.8 HPS、Pm、APP、SS 药物敏感试验 34-35 3

15、 结果 35-53     3.1 HPS、Pm、APP、SS 的分离培养与生化鉴定 35-39         3.1.1 HPS 的分离培养与生化鉴定 35-36         3.1.2 Pm 的分离培养与生化鉴定 36-37         3.1.3 APP 的分离培养与生化鉴定 37-38     

16、60;   3.1.4 链球菌的分离培养与生化鉴定 38-39     3.2 HPS、Pm、APP 复合PCR 方法的建立与应用 39-42         3.2.1 HPS、Pm、APP 复合PCR 体系的优化 39-40         3.2.2 复合PCR 方法的特异性 40-41         3.2.3 复合PCR 的敏

17、感性 41         3.2.4 复合PCR 的临床应用 41-42     3.3 A 型Pm 的PCR 鉴定结果 42     3.4 SS2 的PCR 鉴定结果 42     3.5 分离株HPS 部分生物学特性研究 42-47         3.5.1 HPS 多形态性观察 42-43      

18、60;  3.5.2 HPS 卫星现象 43         3.5.3 HPS 生长曲线 43-44         3.5.4 HPS 分离株16srRNA 序列扩增与测定 44-45         3.5.5 HPS 动物感染试验 45-47     3.6 HPS tbpA PCR-RFLP 分型与tbpA 序列分析 47-50 

19、0;       3.6.1 分离菌tbpA 的扩增 47         3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49         3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、APP、SS 的药物敏感试验 50-53 4 讨论与分析 53-58     4.1 复合PCR 快速检测H

20、PS、Pm、APP 感染的临床意义 53     4.2 安徽省部分地区猪“高热病”中细菌感染情况及其优势血清型/基因型 53-54     4.3 HPS 致病力的影响因素 54-56     4.4 HPS、Pm、APP、SS 分离株药物感受性 56-58 结论 58-59 参考文献 59-66 致谢 66-67 附录 67-73         3.6.1 分离菌tbpA 的扩增 47    

21、0;    3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49         3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、APP、SS 的药物敏感试验 50-53 4 讨论与分析 53-58     4.1 复合PCR 快速检测HPS、Pm、APP 感染的临床意义 53     4.2 安徽省部分地区猪“高热病”中细菌感染情况及其优势血清型/基因型 53-54

22、    4.3 HPS 致病力的影响因素 54-56     4.4 HPS、Pm、APP、SS 分离株药物感受性 56-58 结论 58-59 参考文献 59-66 致谢 66-67 附录 67-73         3.6.1 分离菌tbpA 的扩增 47         3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49      

23、0;  3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、APP、SS 的药物敏感试验 50-53 4 讨论与分析 53-58     4.1 复合PCR 快速检测HPS、Pm、APP 感染的临床意义 53     4.2 安徽省部分地区猪“高热病”中细菌感染情况及其优势血清型/基因型 53-54     4.3 HPS 致病力的影响因素 54-56     4.4 HPS、Pm、APP、SS 分离株药物感受性 56-58 结论 58-59 参考文献 59-66 致谢 66-67 附录 67-73         3.6.1 分离菌tbpA 的扩增 47         3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49         3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、AP