生物大分子纳米孔分析技术研究进展_图文

1、讲述与进展DO I :10. 3724/SP. J . 1096. 2010. 00280生物大分子纳米孔分析技术研究进展丁克俭1, 2 张海燕2 胡红刚2 赵红敏2 关伟军*1 马月辉*11(中国农业科学院畜牧研究所, 北京100193 2(北京交通大学生命科学与生物工程研究院, 北京100044 摘 要 脱氧核糖核酸穿越纳米孔动力学研究以及利用纳米孔开展新型DNA 测序技术研究是后人类基因组计划的热点之一。本文对生物纳米孔、固态纳米孔以及纳米孔生物大分子识别技术的研究现状进行了归纳和总结, 并对该领域的发展趋势进行展望。关键词 纳米孔; 溶血素蛋白; 生物大分子识别; 综述2009 05

2、24收稿; 2009 09 30接受本文系国家自然科学基金项目(No. 10704007 、国家科技支撑项目(Nos . 2006BAD13B08, 2008BADB2B01 和国家科技基础条件平台建设项目(No . 2005DKA21101 资助*E m ai:l yu ehu. i m a 263. n et ; w j guan86i ascaas . net . cn1 引 言生物体内存在大量的膜通道, 用于调控蛋白质、核酸等生物大分子的运输, 并作为新陈代谢的途径1, 包括细菌多孔、线粒体通道、一些毒素通道、核孔复合体以及蛋白引导的内质网通道2, 3。生物体中许多进程都会涉及到生物聚

3、合链穿越嵌入生物膜上通道, 这些通道和生物大分子在空间结构尺度上与纳米技术相吻合, 因此纳米技术的发展为蛋白质、DNA 等生物大分子识别的研究提供了更多的可能性。20世纪90年代, 哈佛大学B ranton 实验室和剑桥大学的Bayley 实验室先后发表了单链DNA 在电场作用下通过纳米孔通道研究发现, 提出了纳米孔DNA 测序的设想46。DNA 序列分析是现代生命科学研究的核心技术之一, 也是人类基因组工程的枢轴。传统用于DNA 测序的方法有双脱氧核苷酸链终止法(Sanger 法 和焦磷酸测序法(Pyrosequenci n g 法 是目前使用最普遍的DNA 序列分析技术。Sanger 法的

4、优势在于可以分析未知DNA 的序列, 且单向反应的读序能力较长, 但是需要昂贵的仪器和试剂。仅测定DNA 单一片断, 焦磷酸测序技术可以检测核苷, 但是会出错, 因为这项技术很难区分单一碱基和一串类似的相邻碱基之间的差异7。可见, 传统用于DNA 测序的方法技术要求高、成本贵, 而且容易出错。因此, 开发出快捷廉价而且准确的DNA 测序方法, 实现1000美元/人的宏伟基因组测序计划, 无疑能显著促进生命科学的发展, 为DNA 测序用于人类疾病临床治疗打开了新的大门。利用生物大分子穿越纳米孔的特点对实现这种新型DNA 测序方法具有重要意义。在过去十几年里, 科学家利用不同的技术研究聚合链(包括

5、核酸 穿越纳米孔, 主要研究方向涉及以下几个方面8:生物纳米孔的自组装和固态纳米孔的制备研究; 通过单链DNA 或RNA 分子穿过纳米孔研究其结构、碱基对组成以及动力学属性913; 通过不同发卡结构DNA 的快速辨别和把DNA 分子短暂地驻留在纳米空间内研究DNA 发卡结构的稳定性14; 基于单链DNA 分子片断能和 溶血素孔( he m o l y si n 或低聚核苷酸共价键结合的DNA 杂交性H ybridization 研制生物传感器15, 16; 一价或二价阳离子束缚位置修饰 溶血素孔, 进而通过这些束缚的阳离子减少了通过孔的电流研究绑定动力学17, 18; 在孔道内部装配非共价键的

6、绑定分子适配器进而调整通道电流堵塞6。本文概述生物纳米孔结构、固态纳米孔研制以及纳米孔生物大分子探测原理, 为纳米孔在生物大分子研究方面的应用提供思路。2 生物纳米孔众所周知, 生物膜上具有各种各样的通道, 基本上都是由纳米尺度的孔道组成(如离子通道, 水通第38卷2010年2月 分析化学(FENX I HUAXUE 评述与进展 Ch i nese Journa l of A na lytica l Che m i stry 第2期280285道等 。目前, 利用生物纳米孔技术研究DNA 排列次序等特性所采用的主要是葡萄球菌 溶血素孔。该纳米孔是众多生物纳米孔中结构组成相对简单、并且研究比较详

7、细的一种溶血素, 是从葡萄球菌中分离出来的一种多肽毒素, 能够自组装进植烷醇卵磷脂类脂双分子层膜中19, 20。1986年, M enestrina 通过单低聚合物的电导率估计 溶血素孔的有效孔径大约为(1. 14 0. 04 nm21。进一步研究表明, 溶血素孔是被溶剂填充的具有蘑菇形的同质低聚物构成的七聚物孔, 其结构如图1所示, 总长约为10nm , 直径约为1. 44. 6nm 20, 其主干部分的高度和直径分别为5. 2和2. 6nm; 七聚物的原聚体的氨基顺时针和相邻原聚体结合, 其富含甘氨酸域的残基以接近180 角缠绕在七重轴周围。在C ap 区域, 原聚体连接通过侧链 侧链相互

8、作用, 主链 主链相互作用, 使得在Ste m 区域Beta 链形成Beta 网格。图1 溶血素蛋白的侧视(A 和正视图(B , 每条色带代表七聚物的原聚体20F i g . 1 V i ew perpendicu lar to the sevenfo l d ax is and approx i m ate l y parall e l to the pu tati ve membrane p l ane (A ; V ie w from t he top o f t he structure and parallel to the sevenfo l d ax is . R i bbon

9、representati ons o f the hemo lysi n( HL heptam er w it h each protome r i n a d ifferen t co lor (B 20典型的穿孔实验中, 单个 溶血素孔在磷脂双分子层上通过自组装方式形成的, 其组装后的微观模型如图2所示22。红色、蓝色、绿色和白色分别表示负电荷、正电荷、极性和非极性链, 绿色小球表示DPPC图2 溶血素蛋白通道在自然环境下组装到磷脂双分子层上的微观模型22F ig . 2 M i croscopic m ode l of HL channel i n its nati v e env i

10、ron m ent , a lipi d b ilayer m e mbrane 22磷脂双分子层的磷原子, 整个模型由288678个原子构成。研究表明, 在1m o l/LKC l 条件下, 约为11个K +和11个C l -可以停留在 溶血素孔内; 在p H >7. 5条件下, 溶血素蛋白孔一直处于稳定开启状态23, 尤其在pH 8. 5和温度在222 时, 发现通过孔的电流在1d 内都保持稳定。3 固态纳米孔尽管 溶血素孔能构满足生物大分子穿越动力学研究, 但是由于生物蛋白寿命和活性的限制, 纳米孔DNA 测序技术的进一步研究受到一定限制。理想的生物物理或生物化学研究应采用孔径稳定

11、、物化性能良好的固态纳米孔。S i 3N 4晶体薄膜是最具潜力用来加工生物物理研究用纳米孔材料之一。目前, 固态纳米研制孔技术, 取得较好结果的技术有同步辐射源技术24, 25、UV 和离子束平板印刷26, 27显微镜电子束技术28和聚焦离子束技术(FI B 技术 29, 30等。其中, 最常见的研制固态纳米孔的聚焦粒子束技术是1990年代发展起来的刻蚀手段, 是第一种专门用于为光刻掩模版修补和集成电路修饰的精细加工技术。能在薄绝缘固态膜上制作纳米孔的带有反馈控制的低能离子束溅射系统基本原理图如图3a 所示。当大量能量为数ke V 的离子碰撞材料表面, 将会导致表面蚀刻, 通常认为每一个激发离

12、子将会从表面移走一个原子3133。利用离子束形成纳米孔基本操作过程图3b 所示。样品是通过化学蚀刻的方法在281第2期丁克俭等:生物大分子纳米孔分析技术研究进展 图3 离子束溅射形成纳米孔策略29F i g . 3 Stra tegy t o m ake nanopo res usi ng argon i on bea m sputte ri ng 29a . 反馈控制系统的低能离子束溅射系统(Spu tteri ng re m ovesm ateri al fro m a free st andi ng S i 3N4m e m brane w it h a cavit y; b .固态S

13、i 3N 4纳米孔形成的基本过程(Feedback con trolled ion bea m scu l p ti ng apparat us housed i n a h i gh vacuum cha mb er 。S i 3N 4膜表面中心形成一个倒置的碗状空腔29, 空腔底部的S i 3N 4层在离子束溅射下逐渐被剥离, 最后形成所需纳米孔。系统的单离子探测装置监控穿过纳米孔的离子束粒子数并决定孔径的大小以及离子束何时停止蚀刻; 同时系统还应包括样品温度控制系统、离子束占空控制系统、样品架控制系统以及离子束流控制系统。哈佛大学的Golovchenko 小组利用3 ke VAr +离子

14、获得孔径可控的S i 3N 4纳米孔29。S tor m 根据与FI B 刻蚀纳米孔基本相同的原理, 利用投射电子显微镜(11E M 上的电子束在S i O 2薄膜上刻蚀出孔径为3nm 左右的小孔。但由于S i O 2薄膜电阻率远低于Si 3N 4晶体薄膜, 目前无法通过微电流法来探测生物大分子28。4 纳米孔生物大分子探测纳米孔生物技术探测DNA 序列的基本思想, 最早可以追溯到1953年Cou lter 在利用毛细管脉冲电阻方法统计电流粒子数的基础上提出了纳米孔探测的概念34, 1970年, DeB lo is 和B ean 重新对这个概念进行了定义35。其纳米孔探测的基本原理:当生物大分

15、子在外界压力下穿过由玻璃等绝缘材料制作的纳米孔或生物纳米孔时会导致通过小孔离子流的阻塞, 小孔电导率的瞬时变化反应了这个过程, 电流的减低量反映粒子的体积大小, 而电流变化的次数则反映生物大分子的数目。随着现代电流放大器技术的发展, Cou lter 方法在分子尺度领域得到了广泛应用36。1994年, B ezrukov 等的实验证明, 在系统中加入乙烯乙二醇时, 通过直径为20nm 丙甲甘肽(Ala m ethic i n 通道的粒子流减少, 对电流波动的分析获得了聚合链在通道内的扩散因子37。近年来, 科学家们已利用纳米孔开展了许多有意义的生命科学研究(原理示意图如图4 3641。单链DN

16、A 或RNA 分子可以加入到膜两边的 C is 或 Trans 容器中, Trans 电极的正电位导致带有负电荷的聚合链进入 H L 孔并从膜的一边滑动到膜的另一边, 在聚合链穿越孔时, 电流急剧下降到原电流的10%左右42, 43。图5是溶液中含有3个碱基数为100的单链DNA 分子, 整个过程发生3次电流阻塞现象37。多聚核苷酸链穿越过程的穿越时间(t 、阻塞发生的间隙( t 以及阻塞电流(I B 可定量的检测出来, 研究表明, t 对多聚核苷酸浓度非常敏感, 而阻塞电流和穿越时间则和多聚核苷酸的基本参数有关。M e ller 等科学家检测单链DNA 分子穿越 溶血素孔导致阻塞电流振幅起伏

17、、 时间滞留等图案的 图4 纳米孔DNA 探测装置示意图3841F i g . 4 Sche m a tics o f nanopore detec tion 3841A . 固态纳米孔DNA 探测示意图(Soli d s t ate nanopore detecti on ; B. 溶血素孔DNA 探测示意图( HL detection 。 图5 穿越事件电流信号表示图42F i g . 5 T hree translocati on events 42The b locked cu rren t corres pond s to tran slocati on ofDNA po l ynu

18、cle oti d es t h rough HL c h anne. l282 分析化学第38卷不同, 区分不同DNA /RNA均聚物Po l y A, Po l y C , Poly U, Po l y dC 以及Poly T 等, 聚合物Po ly A 30C 70结构组成中的两段嘌呤和嘧啶, 也通过此种方法成功鉴别出来12, 13, 4145。Bay lay 研究组通过对 溶血素孔内表面电荷进行操纵进而对生物纳米孔改性, 提高不同的DNA 碱基占据这个纳米孔的时候产生的电流的扩散, 同时他们采用核酸外切酶让DNA 分子以一次一个碱基的速度通过小孔, 这两种技术的结合可以辨别长串的A,

19、T, C 和G 碱基, 而且还能进行更精细的识别, 诸如识别随机序列中的A, C , G, T 这4个碱基中的任何一个, 如图6所示。不过这种技术在单碱基层次上尚未达到可靠的分辨率要求4648。 图6 单通道记录的d GM P, dTM P, d AM P 和dC M P 穿越 溶血素孔的信号47F i g . 6 N ucleoti de event distr i buti ons w it h per m anent adapter si ng le channe l reco rding fro m onebionanopo r show ing dGM P , d TM P, dAM

20、 P and dC M P d i scri m i nati on , w it h co l oured bands added torepresent t he resi dual current distributi on fo r each nuc leo ti de 47迄今, 科学家对于纳米孔甄别DNA 特性实验获得的研究结果主要包括:生物大分子是以一定单体次序穿越 溶血素孔; 每一次穿越事件可由电流信号的变化甄别; 能够测量生物大分子长度和空间结构等。然而, 溶血素孔探测存在一些局限性, 如, 溶血素孔嵌入的凝脂双分子层支架的易破坏性, 对环境因素极其敏感性, 而这些环境因素恰

21、恰是控制DNA 结构的重要因素49; 除此之外, 溶血素内部孔径也仅约为1. 5n m, 只能容许单链DNA, RNA 和聚核苷酸穿越, 限制双链DNA, RNA 的穿越44。因此并不能用它来研究双链DNA 、RNA 或聚核苷酸等的结构性质, 也不可能利用它直接研究DNA 或组蛋白的动力学结构。由于这些条件的限制, 近年来, 固态纳米孔(So li d state nanopo re 逐渐成为纳米孔生物大分子识别研究的热点5057。目前利用固态纳米孔探针开展DNA 穿孔研究, 实验的偏置电压通常设置约为120mV, 穿孔事件、穿孔时间t d 和电流偏差 I b 信息由膜片钳系统获取。最近, 普

22、渡大学B rick 纳米技术中心的研究人员在固相纳米孔检测DNA 技术上取得了突破性的进展46。Bashir 研究组利用绝缘体硅材料(S ilicon on insulator 构建了固相纳米孔通道, 并用发夹(Ha irpin loop 结构DNA 探针修饰纳米孔, 他们发现在电场的作用下与探针DNA 完全匹配的单链DNA 能够迅速通过孔道, 形成狭深的电脉冲图谱, 而即使只有一个碱基不匹配的错配DNA, 通过时速度缓慢、也无特征峰谷形成。该项研究实现了生物纳米孔的选择性与固相纳米孔的稳定性的结合, 为精确模拟生物膜提供了更有效的纳米材料模型, 从而有望实现在芯片上对少量、低浓度的蛋白质、核

23、酸等生命大分子的测定。可以预见, 随着该纳米孔研究的进一步完善, 可以快速提高传统DNA 的测序效率, 扩展DNA 测序的应用领域, 为后基因组学提供有力的研究手段, 以及进一步为临床医药提供更加精准和个性化的诊疗手段。除了利用纳米孔研制新型DNA 测序技术外, 科学家开始尝试利用纳米孔研究DNA 与组蛋白间的相互作用。在前人的基础上, 王鹏业等50, 57提出通过利用FI B 技术研制的纳米孔研究DNA 分子与核小体相互作用方案。众所周知, DNA 分子通过与带正电的组蛋白静电相互作用使得DNA 分子紧密缠绕到核小体上, 因此在适当的外力作用下, 缠绕在核小体上的DNA 分子将被分开。DNA

24、 双螺旋是由两股DNA 单链逆向绕制形成的。具有不同碱基数目、排列次序的ds DNA 片段, 与组蛋白结合成核小体, 其相互作用力、空间结构、构象等不相同, 当其被剥离并穿越纳米孔时, 引起电流阻塞振幅、阻塞时间等变动。双链DNA 与组蛋白八聚体结合在不同的位点上, 这些结合位点也具有不同的结构。在电场力作用下, dsDNA 从八聚体上被剥离下来的过程以及dsDNA 拉伸的扭曲等将导致其它结构的转变等。利用纳米孔研究DNA 与核小体结合动力学, 其基本原理与利用纳米孔进行DNA 的超快速测序技术原理基本相同。不过由于纳米孔的空间结构和阻挡力, 使组蛋白不能穿越, 从而诱使DNA 从组蛋白八聚体

25、上分离下来。因此, 通过准确检测DNA 分子穿孔过程中引起的电流阻塞的振幅起伏、时间迟滞等特性, 可将DNA 与组蛋白的相互作用的一些性质反映出来。5 总结和展望纳米孔作为一种新型的纳米探测器, 其在生物大分子方面的研究方兴未艾, 离子流阻塞效应、电流特征检测以及DNA 特征信息成为DNA 的超快速测序技术实现的关键。但是由于生物大分子聚合物链穿越纳米孔是一个非常复杂的科学问题, 其过程涉及纳米孔与聚合物链的空间结构排列、流体动力学、以及纳米孔 聚合物链间的相互作用等, 尽管目前探测器灵敏度已经足够高, 但是生物大分子链在受限空间中构像变化以及其运动的详细特征还无法直接观测到; 一些非常重要的

26、物理量也只能通过间接方法获得。要达到实用阶段还面对许多挑战性问题, 例如生物大分子穿越纳米孔的稳定性差、穿越速度快以及特征信号弱等。随着纳米孔技术难关的攻克, 今后纳米孔技术的应用研究, 主要将集中以下几个方面:利用纳米孔探测技术与分子生物学技术结合破译生物大分子各级结构与功能; 利用纳米孔研究生物大分子之间的相互作用; 利用纳米孔技术开发疾病诊断系统和新型药物传输系统等, 其在生命科学中的应用必将得到拓宽, 许多生命活动规律将揭示, 纳米孔技术必将给人类的生活带来深远影响。R eferences1 Bezrukov S M. J. M e m br B iol . , 2000, 174(1

27、:1132 H ille B . Ionic Channels of Ex citable M e m branes (Sunderland , M A:S i nauer A sso ciates , Inc . 19843 Lodish H, Berk A, Z i pursky S L , M atsuda ira P , Ba lti m o re D, D arnell J . M olec u l ar Cell B i o logy (4t h (N e w Y ork :F ree m an , 20004 Seo T S , Ba iX P , K i m D H, M en

28、g Q L, Shi S , R uparelH, L i Z M, T urro N J , Ju J Y. Proc . N at . A cad. S ci . USA ,2005, 102:592659315 K asianow ich J J , B rand i n E , Branton D, Deam er D W. P ro c . N atl . A cad Sci . USA , 1996, 93(24Branton D, G o l ovchenko J . N ature , 1999, 398(6729:6606617 G u L Q, B

29、raha O, Con l an S , Cheley S , Bay l ey H. N ature , 1999, 398(6754:6866908 M e ller A. J. Phy s . Cond ens . M a tter , 2003, 15(17:R 581R 6079 Pe terM. N at . B i o tech. , 2001, 19(8:71772110 M e ller A, N i von L, Branton D. P hy s . Rev. Lett . , 2001, 86(15:3435343811 M e ller A, N i von L, B

30、randi n E, G o l ovchenko J , B ranton D . P roc . N atl . A cad Sci . USA , 2000, 97(3:1079108412 D ea m er D W, Bran t on D. A cc . Che m. R es . , 2002, 35(10:81782513 A keson M, Brant on D, K as i anow ich J J , B rand i n E , D ea m er D W. Biophy s J. , 1999, 77(6:3227323314 V ercoute re W, W

31、inters H ilt S , O l sen H, D ea m er D, H auss l er D. N at . B iotech . , 2001, 19(3:24825215 H ow orka S , M ov ileanu L, Braha O, Bay l ey H. P roc . N a tl . A ca d Sci . US A, 2001, 98(23:129961300116 Bay ley H, Cre m er P . N at ure , 2001, 413(6852 :22623017 K asianow icz J J , Burden D L, H

32、 an LC , Che l ey S , Bay ley H. B iophys J. , 1999, 76(2:83784518 Braha O, G u L Q, Zhou L, Lu X, Che l ey S , Bay ley H. N at . B io tech . , 2000, 18(9:1005100719 W a l ker B , K rishnasastry M, Zo rn L, K asianow icz J , B ay ley H. J. B io l . Che m. , 1992, 267(15:109021090920 Song LZ, Hobaugh

33、M R , Shustak C , Che ley S , Bayley H. G ouaux J E. Science , 1996, 274(5294:1859186521 M enestr i na G. J. M e m br B iol . , 1986, 90(2:17719022 A leksij A, K laus S . B iophy J. , 2005, 88(6:3745376123 K asianow icz J J , Bezrukov S M. B iop hy s J . , 1995, 69(1 :9410524 R a ll K S , Buhrman R

34、A, T i ber i o R C. A pp l . Phy s . Lett . , 1989, 55(23:2459246125 S i w y Z , Fu li ns k iA. P hy s . Rev. Lett . , 2002, 89(19:19810319810626 Fabrizi o E D , i F illi po R , Cabrini S , K u m a r R, Pe rennes F, A ltissi m o M, Busi naro L , Co jac D, V accar i L , P rasc i o l u M,Cande l o ro

35、P . J. Phy s . Condens . M atter , 2004, 16(33:S3517S353527 L iM T, Chen L , Z hang W, Chou S Y. N anotechnology, 2003, 14(1:3336第 2期 28 丁克俭等: 生物大分 子纳米孔分析技术研究进展 285 Stor A J Chen JH, L ing X S, Z andbergen H W, D ekker C. N atureM ater ials 2003, 2( 8 : 537 540 m , , 29 L i J S tein D, M c u llan C,

36、 Branton D A zizM J G o lov chenko J A. N ature, 2001, 412( 6843: 166 169 , M , , 30 L i J G ershow M, Ste in D, Brandin E, G o lovchenko J A. N atM ater, 2003, 21( 6: 611 615 , 31 Johnson R E, Shou J M at fy s M eddr, 1993, 43: 403 494 . 32 N enandov ic T, P erra illon B, Bogdanov Z D jo rdjev ic Z

37、 M ilic M. N ucl. Instrum M eth B, 1990, 48( 4: 538 543 , , 33 G naser H. Ion Irradiation of Solid Surfaces( Springer B erlin /H eide lberg, N ew Y o rk 1999 , , 34 Cou lterW H. U. S. P aten, 2. 656 50, 1953 . 35 D eB lo is R W, Bean C P R ev. Sci. Instrum. , 1970, 41( 7: 909 915 . 36 37 38 40 41 Be

38、zrukov S M, V odyanoy I Parseg ian V A. N a ture, 1994, 370( 6487: 279 281 , Bezrukov S M. J. M em br. B io l , 2000, 174( 1: 1 13 . Ild ik S, G y rgy B, F rancesco T, B rin iM, Coppo la A, Zo ratt,i M. J. B iol. Chem. , 1997, 272( 40 : 25275 25282 , Ste in D. N at N ano tech, 2007, 2( 12: 741 742 B

39、ranton D D eame r D W, M arzia li A, B ay ley H, Benner S A, Butler A, V entra M D, G a ra j S, H ibbs A, Huang X, , R amsey JM, R iehn R, Soni G V, Cossa V T, W anunu M, W igg in M, 1146 1153 42 M e ller A, Branton D. E lectrophoresis, 2002, 23( 16: 2583 2589 43 Com er J D i itrov V, Zhao Q, T i p

40、G, Aksi entiev A. B iophy sical J. , 2009, 96( 2: 593 608 , m m m 44 Bezrukov S M, K as ianow icz J J Phys. Rev. Lett, 1993, 70( 15: 2352 2355 . 45 H enr ickson S E, M isak ian M, R obertson B, K asianow icz J J Phy s R ev. L ett , 2000, 85( 14: 3057 3060 . . . 46 M ag lia G, R estrepo M R, M ikha i

41、lova E, Bay ley H. Proc. N atl. A cad S ci. USA, 2008, 105( 50 : 19720 19725 47 C larke J, W u H C, Jayas inghe L, Pate l A, R e id S B ay ley H. N a t N anotech, 2009, 4( 4: 265 270 , . 48 Stoddart D, H eron A J M ikhailova E, M ag lia G, Bay ley H. P roc. N atl. A cad Sci. USA, 2009, do:i 10 1073/

42、 pnas , . . 0901054106 49 H ea ly K, Sch iedt B, M orr ison A P. N anom ed icine, 2007, 2( 6: 875 897 50 W ANG K ai G e(王凯歌 , DOU Shuo X ing (窦硕星 , W ANG P eng Y e( 王鹏业 , (顾 长志 . Phy sics(物理 , 2004 33( 8: 579 586 , 51 52 54 Fo logea D, U p linger J Thomas B, M c abb D S, L i J N ano L ett. , 2005, 5( 9: 1734 1737 , N . . Fo logea D, G e rshow M, L edden B, M c abb D S, G o lovchenko J A, L i J N ano L ett. , 2005, 5( 10: 1905 1909 N . . Sm eets R M M, K eyse r U F W u M Y, D ekker C. P hys. Rev. Lett. , 2006 97( 8: 088101 088105 , , 2( 7 : 473 477 56 Iqba l S M, A k in D, B a