高效液相色谱及蒸发光散射检测器法测定银杏叶片中萜类内酯的含量

1、高效液相色谱及蒸发光散射检测器法测定银杏叶片中萜类内酯的含量    【关键词】  银杏叶片；,质量标准；,高效液相色谱；,蒸发光散射检测器；,萜类内酯摘要：目的测定银杏叶片中萜类内酯银杏内酯A，B，C及白果内酯的含量。方法采用高效液相色谱法（HPLC）以蒸发光散射检测器(ELSD)检测，对银杏叶片中的活性成分银杏内酯A，B，C及白果内酯进行测定。结果银杏内酯A在2.1210.6g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 5），平均回收率为96.0%；银杏内酯B在2.1010.5 g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 3），平均回收率为94.6

2、%；银杏内酯C在1.979.80 g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 6），平均回收率为92.4%；白果内酯在4.1220.6 g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率为93.6%。结论 该方法准确可靠，可用于银杏制剂萜类内酯的质量监控。关键词：银杏叶片；  质量标准；  高效液相色谱；  蒸发光散射检测器；  萜类内酯Determination of Terpene Lactones in Ginkgo Tablet by HPLC and ELSDAbstract：ObjectiveTo determine the conte

3、nt of ginkgolide A，B，C and bilobalide in the Ginkgo tablet.MethodsThe HPLC method with Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) was used to determine the content of ginkgolide A，B，C and bilobalide in  the Ginkgo tablet. ResultsThe method had good linear relationship. The average recovery we

4、re 96.0%,94.6%,92.4%and 93.6%, respectively. ConclusionThe method is accurate and reliable, which can be used for quality control on Terpenelactones of Ginkgo tablet.Key words：Ginkgo tablet；  Quality standard;   HPLC；  ELSD；  Terpene lactones     目前，国内外对银杏Gink

5、go biloba L.叶提取物及其制剂的研究非常广泛。论文论文参考网银杏提取物中有效成分为银杏萜类内酯和银杏黄酮，用于治疗冠心病、心绞痛、老年痴呆症等疾病。经药理研究证明1,2，其中银杏萜类内酯包括白果内酯(bilobalide)、银杏内酯(ginkgolide)A，B，C，J和M，为筛选出的有效的血小板活化因子(PAF)拮抗剂。银杏提取物中萜类内酯的含量测定，文献报道的有TLC3法，HPLCUV4法，HPLCRI5法，GCMS6法等。TLC法重现性差，受环境和操作影响大，而GCMS法需衍生化，操作复杂。HPLC法若采用普通紫外检测器，由于银杏内酯的最大吸收在220 nm左右，样品处理复杂，

6、测定干扰大。示差折光检测器（RI），为通用型检测器，但其对温度等外界因素响应过于灵敏，重现性和检测灵敏度差。ELSD为质量型通用检测器7，近年来应用日趋广泛。本文采用HPLCELSD法，对银杏内酯A，B，C以及白果内酯进行了含量测定研究。现将结果报道如下。1  仪器与试剂  Agilent1100系列四元泵高效液相色谱仪，Agilent化学工作站；法国产SEDEX75型蒸发光散射检测器；四氢呋喃、正丙醇为色谱纯，水为二次重蒸水，其余试剂均为分析纯；银杏叶片由湖北省午时药业提供；银杏内酯A，B，C以及白果内酯对照品购自中国药品生物制品检定所。2  方法与结果2.1&

7、#160; 色谱及检测条件Alltech公司Alltima C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 m）；柱温45；流动相为四氢呋喃正丙醇水(15184)；流速：1 ml/min；蒸发光散射检测器检测参数：漂移管温度40；载气为空气，压力为3.5 bar。2.2  供试品和对照品溶液的制备2.2.1  供试品溶液的制备取本品20片，除去包衣，精密称定，研细。取相当于萜类内酯19.2 mg的粉末8，精密加入甲醇50 ml，称定重量。超声处理40 min，放冷，再称定重量。用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20 ml，回收甲醇，残渣加水1

8、0 ml，置水浴中温热使溶散。加2% HCl溶液2滴，用醋酸乙酯振摇提取4次（15，10，10，10 ml）。合并提取液，用5%醋酸钠20 ml洗涤。分取醋酸钠液，再用醋酸乙酯10 ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤两次，20 ml/次，合并水洗液。用醋酸乙酯10 ml洗涤，合并醋酸乙酯溶液，回收醋酸乙酯至干，残渣用丙酮溶解并转移至5 ml量瓶中。加丙酮至刻度，摇匀，0.45 m滤膜滤过，即得。2.2.2  对照品溶液的制备精密称取银杏内酯A 1.06 mg，银杏内酯B 1.05 mg，银杏内酯C 0.98 mg，白果内酯2.06 mg，置1 ml量瓶中，加适量甲醇溶解，摇

9、匀，即得。2.3  测定方法精密吸取对照品溶液5，10 l和供试品溶液10 l，注入液相色谱仪，测定峰面积。将峰面积及浓度均取常用对数后计算含量，即得。2.4  线性关系考察分别吸取上述对照品溶液2，4，6，8，10 l进样。以峰面积的常用对数为纵坐标，以浓度的常用对数为横坐标，得银杏内酯A，B，C以及白果内酯的标准曲线回归方程和线性范围见表1。表1  各组分的回归方程和线性范围（略）2.5  稳定性实验和精密度实验取对照品溶液分别在0，2，4，6，8，10 h进样，测得银杏内酯A的峰面积RSD为2.11%；银杏内酯B峰面积RSD为1.18%；银杏内酯C

10、峰面积RSD为2.15%；白果内酯峰面积RSD为2.08%。结果表明样品溶液在10 h内稳定，精密度良好。论文论文参考网 2.6  重现性实验取5份供试品溶液，分别测定银杏内酯A，B，C以及白果内酯的含量，结果表明重现性较好，银杏内酯A，B，C以及白果内酯的RSD分别为2.04%，1.88%，1.92%和2.35%。2.7  回收率实验取银杏叶片粉末(含量已知)0.5637g，定量加入上述银杏内酯A，B，C以及白果内酯对照品适量，按供试品溶液制备方法制备，测定。结果见表23。表2  银杏内酯A，B回收率实验结果（略）表3  银杏内酯C、白果内酯回收率实验

11、结果（略）n=52.8  样品测定结果3批银杏叶片样品测定结果见表4，对照品及供试品色谱图见图1。3  讨论ELSD在测定银杏萜类内酯类化合物时，其峰面积与样品浓度的线性关系不太理想，但将峰面积和样品浓度分别取常用对数后，则得到理想的线性关系，这与ELSD的检测机理是相符合的4，5。表4  样品测定结果（略）表中数据为每片中含量a对照品  b样品  1.银杏内酯A2.银杏内酯B  3.银杏内酯C  4.白果内酯图1  对照品和样品的高效液相色谱图（略）在测定银杏内酯含量时，曾经采用中国药典的方法8用混合对照品溶液1

12、0 ，15 l进样，测定。结果发现样品的含量在直线方程以外，误差很大。因此，改用混合对照品溶液进样量为5，10 l，用外标两点法对数方程分别计算萜类内酯的含量，可以减小误差，得到较满意的结果。该方法操作简便，精确可靠，稳定性和重复性好。参考文献：1BraquetP. Theginkgolide:Potentplateletactivatingfactorantagonistsisolatedfrom Ginkgobiloba L.:Chemistry, pharmacology and clinical applicationJ.DrugsFuture,1987,12(7)：643.2

13、0; Kleijnene, J.Knipschild P.Ginkgolide BilobaJ.Lancet, 1992, 340(7)：1136.3  颜玉贞,谢培山,钱浩良.银杏叶提取物及制剂萜类内酯薄层色谱荧光扫描定量测定研究J.中国中药杂志，1997,22(3)：159.4  池静端,刘爱茹.HPLC法测定银杏叶中三种内酯成分J.药物分析杂志,1998,18(6)：367.5  VanBeekTA, ScheerenHA, RantioT. Determination of ginkgolide and bilobalide in Ginkgobiloba leaves and phytopharmaceutids J.JChromatogr, 1991,543：375.6NathalteC, JulieC, MicaelM.GaschromatogrophicMassspectrometicanalysisofginkgolideproducedbyGinkgobilobacellcultureJ.JChromatogr,1