黄连多糖含量测定及抗氧化活性研究

1、黄连多糖含量测定及抗氧化活性研究                         作者：吴玉娟 王懿萍 姜延伟，姜怡 【摘要】  目的比较3种pH值条件下提取的黄连多糖的含量及抗氧化活性差异。方法采用蒽酮硫酸法测量黄连多糖的含量。分别测定黄连多糖对?OH，O2-?，DPPH的抗氧化活性。结果黄连药材中多糖含量为：碱提取多糖>水提取多

2、糖>酸提取多糖。抗氧化研究结果表明，在pH值中性条件下，水提取多糖经木瓜酶与Sevag法除蛋白得到的多糖在抗氧化实验中显示出较好的效果，对?OH的EC50为83.913 g/ml，对DPPH的EC50为249.856 g/ml，对O2-?则无明显的抑制作用。河南学术科研网结论黄连多糖可作为抗氧化剂，具有较好的清除自由基的作用。 【关键词】  黄连 多糖 含量测定 抗氧化活性Abstract：ObjectiveTo compare the differences of content and antioxidant activity of Coptis chinensis pol

3、ysaccharides between three pH levels rate.MethodsAnthrone-sulphuric acid method was adopted to survey the content of polysaccharide in Coptis chinensis.Inhibition rate of ?OH, O2-? and DPPH was used to detect its antioxidant activity.ResultsThe content order of polysaccharide in Coptis chinensis was

4、:polysaccharide extracted with base liquor>polysaccharide extracted with water>polysaccharide extracted with acid liquor.The antioxidant activity experiment showed that PSA3 extracted with water and deproteined with papain and Sevag method had better effect. EC50 of PSA3 against?OH was 83.913g

5、/ml，and against DPPH was 249.856g/ml.But PSA3 had no effect against O2-?.ConclusionCoptis chinensis has free radical scavenging activity and can be used as a antioxidant.Key words：Coptis chinensis；  Polysaccharide；  Assaying；  Antioxidant activity    黄连为毛茛科植物黄连Coptis ch

6、inensis Franch.，三角叶黄连C. deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连C. teeta Wall.的干燥根茎，是清热燥湿、泻火解毒的良药1，最早记载于东汉神农本草经，并列于上品。目前，国内外对黄连有效成分的研究大多集中于其生物碱，尤以小檗碱的研究为多，未发现对黄连多糖的研究。本文对比研究3种pH值条件下提取的黄连多糖的含量及体外抗氧化活性差异，为充分开发利用黄连资源及新药研发提供依据。1  材料与仪器1.1  材料黄连，产地峨眉，采收于2006年冬至前后，经生药学教授王盛民鉴定为4年生味连。DPPH，英国Alfa，95%；其余试剂

7、均为国产分析纯。实验提取及分析用水为超纯水（18.23 M?汀?cm-1）。1.2  仪器TU1901紫外-可见分光光度计，北京普析；FA1004-53423电子天平(0.0001g)，上海精科；TDL-5-A低速大容量离心机，上海安亭；DZF-6030B真空干燥箱，上海齐欣。KL-UP超纯水器，成都优普；PHS-3C型pH计，上海雷磁；JJ-1A60W数显电动搅拌器，江苏富华。2  方法2.1  样品制备2.1.1  提取称取粉碎至20目的黄连粗粉3份，每份60 g，分别置于索氏提取器中用5倍无水乙醇回流脱脂6h。滤渣挥干后，分别加入10倍水、10倍0

8、.1 mol/L NaOH溶液、10倍0.1 mol/L HCl溶液，80水浴回流提取1 h。提取液调pH值至中性，抽滤，各旋蒸浓缩至300 ml。2.1.2  除蛋白每份提取液等分3份，各100 ml，按表1方法除蛋白。见表1。表1  除蛋白方法（略）2.1.3  醇沉经表1方法处理后的9份提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液用0.22m微孔滤膜抽滤，将95%乙醇缓慢加入滤液中，边加边搅拌，调醇浓度至80%，在冰箱中4静置12 h后取出。将醇沉液以5 000 r/min离心5 min，倾弃上清液。在得到的沉淀中再各加80%乙醇50 ml，搅拌并

9、超声5 min后以5 000 r/min离心5 min，倾弃上清液，重复此步操作至上清液无色(58)次。再用无水乙醇重复上步操作3次，真空干燥后即得灰白色粉末状的黄连多糖。2.2  含量测定参照2005版中国药典，采用蒽酮硫酸法2测定多糖含量。经波长扫描，在624 nm处有最大吸收。2.2.1  蒽酮试剂配制称取0.400 0 g蒽酮，加6ml无水乙醇助溶，再加75%硫酸200 ml，摇匀，置棕色瓶中备用。2.2.2  标准葡萄糖溶液的配制称取105干燥至恒重的无水葡萄糖0.050 0 g，配制200 g/ml葡萄糖溶液250 ml。分别吸取5，10，15，20，

10、25，30 ml于50 ml容量瓶中，定容后作为葡萄糖标准溶液。2.2.3  标准曲线的制备在具塞试管中依次加入不同浓度的标准葡萄糖溶液2 ml和蒽酮试剂8 ml，摇匀，沸水浴20 min，冷却至室温后，在624 nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.2.4  含量测定样品在60干燥至恒重，配制为100 g/ml供试液，按标准曲线制备项下方法测定吸光度值，多糖含量(C×V×D)/W，生药含量多糖含量×M/20。式中C为测得的样品溶液的葡萄糖质量浓度(g/ml)，D为样品溶液的稀释倍数，V为供试液体积(ml)，

11、W为供试品的质量(mg)，M为醇沉后得到的多糖的质量(g)。百事通2.3   抗氧化活性研究2.3.1  黄连多糖对?OH的抑制作用原理：采用Fenton体系3测定黄连多糖对?OH的抑制作用。?OH由EDTA-Fe-H2O2产生，由于?OH可特异性地使番红花红T褪色，根据褪色程度可以衡量?OH生成量。经波长扫描，反应体系在554 nm处有最大吸收。    方法：在具塞试管中依次加入100 g/ml番红花红T 2 ml，0.2mol/L pH7.4的PBS 2 ml，100 g/ml供试液2 ml，0.3%H2O2 2 ml，0.15

12、mmol/L EDTA-Fe2+2  ml，混匀后37水浴30 min。抑制率(E)=(A样品-AEmin)/(AEmax-AEmin)，式中Emin为以水代替供试液，Emax为以水代替供试液和EDTA-Fe2+。2.3.2  黄连多糖对 O2-?的抑制作用原理：邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出超氧阴离子，生成的中间产物在紫外区有吸收4。经波长扫描，在320 nm处有最大吸收。经时间扫描，该反应在4  min后趋于平缓。方法：在具塞试管中依次加入100g/ml供试液4 ml，0.05 mol/L pH8.2的Tris-HCl 4ml，37水浴预热10 mi

13、n，再加入4 mN1 mN邻苯三酚盐酸溶液1 ml，混匀后在37水浴中以跑表计时准确反应4 min，立即用6 mol/L HCl 1ml终止反应。抑制率(E) =(AEmax-A样品)/ (AEmax-AEmin),式中Emin为以水代替供试液、Tris-HCl，Emax为以水代替供试液。2.3.3  黄连多糖对DPPH的清除作用原理：DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)是一种带有不配对电子的比较稳定的自由基，其N原子上有一个游离电子。DPPH的40%乙醇-水溶液在526 nm处有最大的吸收峰。加入抗氧化剂后，DPPH捕捉一个电子与游离电子配对，在5

14、26 nm处的吸收减弱5，6。    方法：在棕色容量瓶中加入100g/ml供试液6 ml，60g/ml DPPH醇溶液4 ml中，混匀后在室温下反应30 min。对DPPH自由基的清除率(E)= (AEmax-A样品)/AEmax，式中Emax为以水代替供试液。3  结果与结论3.1  结果3.1.1  标准曲线的制备及含量测定 通过蒽酮硫酸法测得实验结果（见表2），标准曲线方程为Y = 0.006 9X + 0.000 4，r2=0.999 7，线性范围：15.07131.01g/ml。表2  黄连多糖纯度及含量测定结果

15、（略）3.1.2  黄连多糖对?OH的抑制作用实验结果表明，9种多糖水溶液对?OH的生成均有较强的抑制作用，见图1。以不同浓度的PSA3作量效关系实验(见表3)。采用SPSS 13.0软件作概率单位回归(Probit Analysis)分析，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，经概率对数变换(probability-logarithmic transformation)7，将S型量效曲线变换为线性回归方程：PROBIT=-2.359 6+1.226 5X（13 iterations，26.188，P=0.402，拟合良好），EC50为83.913g/ml（95%置信区间为69.782

16、101.320）。实验以甘露醇作对照品，EC50为1.625 mg/ml。表3  PSA3对?OH的抑制作用（略）3.1.3  黄连多糖对O2-.的抑制作用实验结果表明，酸提多糖溶液对O2-?的生成有一定的抑制作用，见图2。以PSC1作量效关系实验，结果见表4，经概率对数变换得回归方程：PROBIT=-4.668 9+2.024 3X（15 iterations，211.026，P=0.088，拟合良好），EC50为202.473g/ml（95%置信区间为161.744255.182）。实验以Vc作对照品，EC50为29.545 g/ml。表4  PSC1对O2-

17、.的抑制作用(略)3.1.4  黄连多糖对DPPH的清除作用实验结果表明，9种多糖水溶液对DPPH自由基均有较强的清除作用，见图3。以PSA3作量效关系实验，结果见表5，经概率对数变换得回归方程：PROBIT=-3.819 8+1.580 1X（14 iterations，218.942，P=0.004，拟合良好），EC50为249.856 g/ml（95%置信区间为177.312380.469）。实验以Ve作对照品，EC50为7.296 mg/ml。表5  PSA3对DPPH自由基的清除作用(略)3.2  结论蒽酮硫酸法测得3种不同pH值条件下提取的多糖含量为：

18、碱提取多糖>水提取多糖>酸提取多糖。    木瓜酶与Sevag法结合除蛋白效果明显优于单用Sevag法除蛋白，得到的黄连多糖的纯度更高。黄连多糖抗氧化研究结果表明，9种多糖水溶液均有一定抗氧化作用。其中PSA3显示出较好的效果，对?OH的EC50为83.913 g/ml，明显优于对照品甘露醇，对DPPH的EC50为249.856 g/ml优于对照品Ve。而对碱性条件下邻苯三酚产生的O2-?则无明显的抑制作用。综上，黄连多糖可作为抗氧化剂，具有较好的清除自由基的作用。【参考文献】  1王强.中药分析M.北京：中国医药科技出版社,2005：306.2国家药典委员会.中国药典,部S.北京：化学工业出版社，2005：215,附录A.3Stéphane Caillet,Hanling Yu.Fenton reaction applied for screening natural antioxidantsJ.Food Chemistry, 2007, 100(2)：542.4许伸鸿,杭 瑚,