植物组织培养实验指导

1、植物组织培养实验指导教师：任峻1 / 15目 录实验一 参观植物组织培养实验室实验二 培养基母液配制实验三 培养基配制与灭菌实验四 植物快速繁殖培养实验考核一、课程的性质与任务植物细胞工程实验技术一般包括植物细胞组织离体培养技术、细胞融合技术、细胞拆合技术、外源基因转移技术等一系列重要的基础技术。通过实验课程的学习，实验方法立足于初学者的专业基础和一般实验室的条件，将植物细胞组织培养技术课程的理论知识、一般的实验技能和科学研究的初步方法融为一体。培养学生理论联系实际、独立思考及实践动手能力。二、实验的目的与基本要求通过本课程的学习使学生掌握植物细胞工程技术的基本原理和实验操作方法，掌握植物细胞

2、体外培养技术，结合科研和生产实际，提高学生分析问题、解决问题的能力。以适应今后在教学、科研和生产开发等各方面对当代生命科学人才知识结构的需求。在实验教学过程中，要求学生学习态度严谨，操作动作规范，观察记录耐心细致，独立思考，综合分析实验结果，充分理解后认真地完成实验报告。09本植物组织培养实验考核一、考核方式：实验操作。二、考核时间：三、考核地点：四、监考教师：实验考核以实验操作形式进行，根据实验4或实验5实验的实验结果（失败或成功）决定实验方案，如果失败，分析失败原因，提出改进措施，在重做中进行实验操作考核，如果成功则继续下一步的实验，实施实验操作考核。二考核办法：考核方法主要观察学生的实验

3、操作是否正确，污染率是否高，并要求学生写出实验报告，总结实验中常出现的问题。在3个课时内小组协作完成实验内容。包括以下几个方面：1对实验仪器设备的选择及操作。湿热灭菌操作过程；无菌操作过程。2.培养基的配制试剂的配制；母液的移取；实验配方计算。3.培养条件的设置。4.实验报告的规范性与科学性。 实验一 参观植物组织培养实验室一、实验的目的和要求掌握植物组织培养实验室的设计要点和必备的仪器设备。二、实验内容：1. 植物组织培养实验室的设计要点。2. 植物组织培养实验室必备的仪器设备。三、需用的仪器或试剂四、实验步骤五、教学方式：参观。六、考核要求：每小组对植物组织培养实验室各功能室的仪器设备进行

4、有效配置。七、实验报告要求1.认真观察，如实记录：记录参观实验室所用的设备。2.说明准确，层次清晰3.格式规范，表述科学：用简图表示植物组织培养实验室的设计。实验二 培养基母液配制一、实验的目的和要求1.了解植物外植体离体培养所需各种营养成分及激素种类2. 初步掌握培养基母液配制方法二、实验内容：母液配制方法，以MS培养基为例。                     

5、0;         1无机大量元素母液的配制按培养基配方的需要量，将各种化合物称量扩大10倍，用粗天平称取，并分别用200ml蒸馏水溶解于400ml烧杯中，如溶解速度慢，可稍加热。在1000ml烧杯中，按表1-1顺序依次混合已熔化合物溶液并搅拌，以免产生沉淀，用量筒定容至1000ml，倒入试剂瓶中并贴好标签。保存于冰箱冷藏室待用。  表1-1     MS无机大量元素母液配制       

6、60;  mg/L   化合物名称     培养基配方用量        扩大10倍称量            备注 KNO3             1900     

7、               19000        定容于1000ml蒸馏 NH4 NO3           1650              

8、;     16500        水中。每升培养基取MgSO4 ·7H2O        370                    3700      

9、  此液100mlKH2 PO4            170                    1700     CaCl2·2H2O        &#

10、160; 440                    44002无机微量元素母液配制按培养基配方需要量，将各种化合物扩大10倍，用电子天平称取，并分别用50ml烧杯20ml蒸馏水溶解，在100ml烧杯中将上述溶液依次混合，用100ml量筒定容（药品已浓缩100倍），倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱中。表1-2     MS无机微量元素母液配制  

11、;        mg/L化合物名称    培养基配方用量     扩大10倍称量        备注       MnSO4 ·4H2O         22.3       &

12、#160;      223     定容于100ml蒸馏       ZnSO4 ·7H2O          8.6               86    

13、0;   水中。每升培养基       CuSO4 ·5H2O        0.025              0.25        吸此液10ml。       H3 BO

14、3               6.2               62               Na2 MoO4 ·2H2O    &

15、#160; 0.25               2.5       KI                  0.83         &#

16、160;     8.3CoCl2· 6H2O         0.025              0.25      3铁盐母液配制按培养基配方需要量，将两种药品扩大10倍，用电子天平称取，分别在50ml烧杯中溶解后，再在100ml烧杯中混合，定容于100ml量筒（浓缩100

17、倍），倒入棕色试剂瓶（因铁盐不稳定，易分解）中，贴上标签，置于冰箱中保存。          表1-3       铁盐母液配制              mg/L       化合物名称    培养基配方用量 

18、0;    扩大10倍称量       备注   FeSO4 ·7H2O         27.8               278         定容至100ml&

19、#160;  Na2 EDTA          37.3               373         每次取用10ml4有机母液母液配制按培养基配方需要量，将各种化合物扩大10倍，用电子天平称取，分别用50ml烧杯20ml蒸馏水溶解，在100ml烧杯中依次混合，100m

20、l量筒定容（浓缩100倍），倒入试剂瓶中，贴上标签，置于冰箱冷藏备 表1-4        有机物母液配制             mg/L 化合物名称    培养基配方用量     扩大10倍称量         备注   甘氨

21、酸                  2.0           20          定容至100ml   盐酸硫胺素(维生素B1)    0.4   &#

22、160;        4          每升培养基取   盐酸吡哆醇(维生素B6)    0.5            5          此液10ml   烟酸

23、                    0.5            5   肌醇                

24、60;  100           1000  5激素母液配制各类激素用量较小，为了方便和准确，也配制成母液。母液浓度可依需要和习惯灵活确定。但注意各激素均不能直接用蒸馏水溶解，而用各种不同溶剂先溶解后再用蒸馏水定容。例如2.4-D母液配制：称取40mg 2.4-D, 用少量95%酒精或1N NaoH溶解后，再用蒸馏水定容至200ml，此时，该激素母液浓度为1mg/5ml。一般地，NAA、IAA、IBA等生长素是醇溶性的，均可用少量95%酒精先溶后再蒸馏水定容，而KT、6B

25、A、ZT等细胞分裂素可先用少量1N HCl或1N NaoH溶解后再用蒸馏水定容。冰箱保存。上述各种母液冰箱保存均不宜时间过长，储藏中如发现母液中出现沉淀或霉团时，应弃之。三、需用的仪器或试剂等1用具器材   电子天平（感量0.1 g、0.001g）、粗天平（感量0.5g）、冰箱、烧杯（1000ml、400ml、100ml、 50ml）、量筒（1000ml、100ml、50ml）、试剂瓶（1000ml、250ml、150ml）、药勺、玻璃棒等。 2药品试剂蒸馏水、1N HCl、1N NaOH、95%酒精、各种所需化学药品（分析纯）四、实验步骤确定培养基 称量 溶解 贴标签 母

26、液分装 定容 保存于冰箱冷藏五、教学方式：教师讲解原理，示范，学生独立操作。六、考核要求：写出你所配制的各种母液配方。七、实验报告要求1认真操作，如实记录2说明准确，层次清晰3格式规范，表述科学实验三 培养基配制与灭菌一、实验的目的和要求学习掌握培养基配制方法与灭菌操作。二、实验内容：1培养基配制 2培养基灭菌三、需用的仪器或试剂1用具器材电子天平、高压灭菌锅、PH仪、塑料量杯、烧杯（500ml、100ml）、量筒（100ml、25ml、10ml）、移液管（5ml、1ml）、三角瓶（50ml）、玻璃棒、药勺、pH试纸（5.4-7.4）、橡皮吸球、橡皮筋、吸水纸、羊皮纸、防潮纸2药品试

27、剂蒸馏水、蔗糖、琼脂、1N NaOH、1N NCl、各种培养基母液。四、实验步骤1培养基配制  （以MS1升培养基为例）(1)称琼脂7g（琼脂浓度0.7-0.8）溶于2/3或一半以上所需培养基体积即700ml左右的蒸馏水中，用电饭锅（或微波炉）煮融。另称取蔗糖30g（糖浓度3%），待琼脂完全煮融断电后趁热加入，并搅拌使之溶解。煮琼脂的同时，可用量筒或移液管依次量取各种母液混合于一烧杯中：无机大量母液100ml，无机微量、有机物、铁盐母液各10ml，激素母液种类及取量依不同培养基配方临时确定。(2)将上述两种液体混合，并用蒸馏水定容为1000ml。  &#

28、160; 用1N NaOH或1N NCl调pH值至5.8，调时应不断用玻璃棒搅动，并用PH仪或pH试纸测试。(3)趁热将培养基分装于约30个三角瓶（50ml）中，每瓶约30ml。分装时应避免把培养基倒在瓶口上，否则易引起杂菌污染。(4)用羊皮纸、橡皮筋封口，并可在纸盖上用铅笔写明培养基代号。2培养基灭菌把分装好的培养基、无菌水及无菌纸放入高压灭菌锅内，锅外层加水后，拧紧锅盖，关闭放气阀和安全阀，接通电源，开始加热，当温度上升指针移至0.5kg/cm 时，开气阀排除冷气，使压力表指针复零位，按同样方法再排一次冷气，关好放气阀继续加热至1.1-1.2kg/cm 时，保持该压力15-20分

29、钟（温度为121-126）后切断电源，打开放气阀，慢慢放热气，锅内蒸汽完全放出，气压归零后打开锅盖，趁热将培养基取出，待冷却后使用。五、教学方式：教师讲解原理，示范，学生独立操作。六、考核要求：请写出你所配置培养基的主要步骤和过程七、实验报告要求1规范操作，如实记录2说明准确，层次清晰3格式规范，表述科学实验四  植物器官愈伤组织的诱导、增殖、分化第一步：愈伤组织的诱导一、实验的目的和要求1了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求2初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种操作技术3了解外植体愈伤组织诱导过程二、实验内容1接种前准备2.培养材料灭菌3接种4.培养与观察三、需用的仪器或试剂1用

30、具器材超净工作台、枪形镊、解剖刀、酒精灯、酒精缸、玻璃记号笔、脱脂棉、火柴、加盖小烧杯、废液杯、刀片2药品试剂70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、已灭菌培养基及无菌水、无菌纸3实验材料新鲜胡萝卜或水稻稻种（带谷壳）等四、实验步骤1接种前准备（1） 按本实验目的事先配好培养基胡萝卜愈伤组织诱导培养基：MS+2.4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L其他接种材料培养基：MS+2.4-D 2mg+6BA 0.2mg（2） 接种室准备  打开超净工作台开关（接种前开机15-30分钟），拖地板减低室内灰尘，台内用70%酒精棉球擦拭干净（或喷雾消毒），台面上放置以下用具：酒精灯、70%酒精

31、缸、酒精棉球瓶、加盖小烧杯、废液杯、枪式镊子、解剖刀、无菌水、无菌纸、培养基、新鲜材料。2.培养材料灭菌培养材料灭菌，是组培技术中的重要环节，一方面要考虑灭菌剂的杀伤效力，同时，也要考虑植物材料的受损情况。所以灭菌时间长短很重要。灭菌时，将选出的健壮无病、幼嫩的茎叶材料稍处理至能放入加盖小烧杯中，玉米将籽粒剥下、胡萝卜用刀片刮去皮切成小块、水稻剥去谷壳后均放入小烧杯中，倒入升汞盖盖灭菌10分钟（具体时间依材料而定），其间稍加摇动以充分灭菌。也可在此之前先用70%酒精浸30秒或1分钟表面消毒后，再用升汞灭菌。10分钟后，倒去升汞溶液，用无菌水反复冲洗材料3遍以上，将升汞溶液及废水倒入废液杯中。3

32、接种（1）接种前用肥皂洗手（穿工作服，戴口罩和工作帽），然后用70%酒精棉球擦手表面消毒。（2）将超净工作台上三角瓶的封口橡皮筋打开，整齐排列在接种台左侧。（3）点燃酒精灯，将所用镊子、刀在酒精缸内沾以70酒精后，在酒精灯火焰上灼烧灭菌，灼烧灭菌后放在支架上以防再污染。在整个接种过程中，应每隔一段时间便将刀、镊子沾酒精灼烧一下灭菌，冷却后再用。（4） 用镊子打开无菌纸包装，夹出几张无菌纸置于台中央。（5） 外植体处理：用无菌镊子取出外植体，置于纸上吸水并进行切割。茎段切成1cm左右长，嫩叶切成 1cm2大小。玉米粒用无菌解剖刀和镊子轻轻剥去果皮（也是种皮），小心切下胚（白色

33、），去掉胚乳（黄色）。水稻完整籽粒在无菌纸上沥干水分即可。胡萝卜块用解剖刀切成一系列1mm左右厚的薄片，每片切成通过形成层的5mm见方的小块，这样每块外植体都包含韧皮部、形成层和木质部三部分，其外植体大小及厚度尽量一致。（6） 在酒精灯上方，左手握住三角瓶，右手轻轻打开并拿掉包头纸，将纸盖外面朝上置于台面上。右手用镊子将茎段、叶或胡萝卜片平摆放于培养基表面，玉米胚或水稻籽粒平放或斜插均可，轻轻按住外植体使其接触培养基。注意接种材料要摆放均匀且保持一定密度，完毕后将三角瓶瓶口在酒精灯火焰上灼烧一下，然后用瓶盖封口，扎好橡皮筋，并用玻璃记号笔在瓶下方注明材料代号、培养基代号、接种日期及姓

34、名等。(7)  将培养基放入培养室指定培养架上培养。注意：在超净工作台上接种时，应尽量避免说笑，打喷嚏。打开包头纸时，注意不要污染瓶口，并进行瓶口灭菌。另外还应注意，手臂切勿从培养基、无菌材料、切割用的无菌纸、接种器械上方经过，以避免再度污染。4.培养与观察接种后一周内，如有污染情况即可观察到，真菌污染菌丝清晰可见，呈黑、白各色。如细菌污染，为粉红、白色或黄色粘稠菌斑，发现污染应及时转移未污染材料或处理掉。未污染培养2-4周后，可在外植体或其切口处观察到已长出的疏松呈颗粒状愈伤组织。五、教学方式：讲授主要的注意事项，示范接种的过程，学生动手操作。六、考核要求：记录接种情况并统计愈伤组

35、织出愈率及污染情况。七、实验报告要求1认真观察，如实记录：污染情况把污染类型分开统计。2说明准确，层次清晰3格式规范，表述科学第二步：愈伤组织的增殖一、实验的目的和要求了解愈伤组织离体条件下增殖过程及条件。二、实验内容将水稻种胚诱导产生的愈伤组织或胡萝卜根外植体产生的愈伤组织在无菌纸上切割成5×5mm大小，转移至愈伤组织增殖培养基上培养。三、需用的仪器或试剂1用具器材超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、脱脂棉、火柴、刀片2药品试剂70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（以下培养基配方供参考）愈伤组织增殖培养基：MS+2，4-D 0.

36、5mg/L+CH 500mg/L + 3%蔗糖+0.7%琼脂  3实验材料各类已诱导产生的愈伤组织四、实验步骤1. 增殖培养基的配制与灭菌2.接种3.培养与观察五、教学方式：学生动手操作。六、考核要求：记录每瓶培养基接种材料名称、外植体数，2-3周后统计愈伤组织生长情况。 七、实验报告要求1认真观察，如实记录：愈伤组织生长情况用照片展示出现的各种典型状况。2说明准确，层次清晰3格式规范，表述科学：用表格统计统计愈伤组织生长情况。 第三步：愈伤组织的分化一、实验的目的和要求了解愈伤组织离体条件下形态发生、器官再生作用。二、实验内容：1茎芽分化2胚胎发生三、需用的仪器

37、或试剂1用具器材超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、脱脂棉、火柴、刀片2药品试剂70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（以下培养基配方供参考）水稻茎芽分化培养基：MS+6BA 2mg/L胡萝卜胚胎发生培养基：MS 无激素培养基MS+2.4-D 5mg/L  (对照)3实验材料各类已增殖培养的愈伤组织四、实验步骤1茎芽分化将水稻种胚诱导产生的愈伤组织（或已继代）在无菌纸上切割成5×5mm大小，转移至MS+6BA 2mg/L培养基上诱导成芽。2胚胎发生将胡萝卜根外植体产生的愈伤组织（或已经继代）分别接种于无激素和含激素2.4-D培养基上，诱导胚状体形成。五、教学方式：讲授与实验。六、考核要求：记录每瓶培养基接种材料名称、外植体数，2-3周后统计水稻外植体发芽率及胡萝卜外植体胚状体诱导率。