丁基苯酞对缺血脑组织中及低糖低氧刺激后培养的神经细胞中胆碱乙

1、丁基苯酞对缺血脑组织中及低糖低氧刺激后培养的神经细胞中胆碱乙酰化酶活性的影响摘要目的：观察丁基苯酞(dl-NBP)，d-NBP和l-NBP对脑缺血后皮层和纹状体中以及低糖低氧和NMDA刺激后培养的胎鼠皮层神经元中胆碱乙酰化酶活性变化的影响。方法：大脑中动脉堵塞起始处造成大鼠局灶性脑缺血；胎鼠皮层神经元以低糖低氧培养基培养造成低糖低氧模型；胆碱乙酰化酶活性以分光度法进行测定。结果：脑缺血后缺血区皮层和纹状体中胆碱乙酰化酶活性分别下降了61.3%和58.4%。dl-NBP，d-NBP和l-NBP(10和20mg；g-1，ip)于脑缺血后5和60min给药2次皆可显著提高脑组织中胆碱乙酰化酶活性。d

2、l-NBP，d-NBP和l-NBP(0.110mol.L-1)对低糖低氧及NMDA刺激后神经细胞中胆碱乙酰化酶活性也有明显的提高作用。结论：dl-NMP改善局灶性脑缺血后动物的学习记忆功能可能与其对胆碱能神经功能的改善有关键词丁基苯酞；脑缺血；神经元；低糖低氧；胆碱乙酰化酶Effect of dl-3-n-butylphthalide on the activity of the choline acetyltransferase in ischemic brain and cultured neurons subjected to hypoglycemia/hypoxiaChong Zhao

3、zhong (Chong ZZ),Feng Yipu (Feng YP) (Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Beijing100050)ABSTRACTOBJECTIVE:To investigate the effects of dl-3-n-butylphthalide (dl-NBP),d-NBP and l-NBP on the activity of choline acetyltransferase (ChAT) in ische

4、mic brain after focal cerebral ischemia and in neurons subjected to hypoglgcemia/hypoxia.METHODS:Focal cerebral ischemia was induced by blockade of the origin of middle cerebral artery (MCAO) and perinatal cortical rat neurons was cultured with hypohlycemia/hypoxic medium to induce hypoglycemia/hypo

5、xia injury.The activity of ChAT was determined spectrophotometrically.RESULTS:The results indicated that the activity of ChAT was decreased by 61.3% and 58.4% respectively in cerebral cortex and striatum after six hours of MCAO.dl-NBP,d-NBP and l-NBP (10 and 20mg.kg-1，ip) were shown to increase ChAT

6、 activity in ischemic brain significantly.The decreased activity of ChAT in cultured perinatal rat cortical neurons induced by hypoglycemia/hypoxia or by NMDA was also improved by dl-NBP,d-NBP and l-NBP (0.110mol.L-1).CONCLUSION:The effect of dl-NBP on learning and memory function impaired by focal

7、cerebral ischemia may be related to its protective effect on the activity of choline acetyltransferase.KEYWORDSdl-3-n-butylphthalide,cerebral ischemia,neuron,hypoglycemia/hypoxia,choline acetyltransferase我们的实验发现，丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide,dl-NBP)对大脑中动脉阻断后的大鼠1及闭合性脑外伤后小鼠记忆功能障碍皆有明显的改善作用。大脑中动脉阻断后主要导致皮层和

8、纹状体及基底节等部位缺血。海马和颞叶皮层是与学习记忆功能重要的相关部位。而中枢胆碱能神经功能在学习记忆过程中发挥重要作用。胆碱乙酰化酶为胆碱能神经递质乙酰胆碱的合成酶，其活性可反应胆碱能神经的功能状态。本实验我们测定了脑缺血后皮层和纹状体中胆碱乙酰化酶活性的变化并观察了药物治疗后对其活性的影响；在培养的胎鼠皮层神经元上，进一步研究了dl-,d-和l-NBP对低糖低氧及NMDA刺激后胆碱乙酰化酶活性变化的影响。1材料和方法1.1药品与试剂丁基苯酞(dl-NBP，本所药物化学合成室提供)；乙酰辅酶A(Sigma公司)；4，4?-二亚硫基二吡啶(4-PDS，Sigma公司)；MK801(Sigma公

9、司)；N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA，MW147.13，Sigma公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；多聚赖氨酸(Sigma公司)；阿糖胞苷(Up-John公司)。1.2局灶性脑缺血模型Wistar大鼠(，中国医学科学院动物繁育中心)，体重(2548)g，以100g.L-1的水合氯醛麻醉(400mg.kg-1,ip)，室温保持在2425,动物体温以白炽灯(100W)维持在37左右。动物仰卧固定，沿颈部中线切开皮肤及皮下组织。手术显微镜下分离右侧颈总动脉及其颈内和颈外分枝。结扎颈外动脉的小分枝及终末枝。夹闭颈总和颈内动脉，将预先硅化的直径为0.26mm的尼龙线插入颈外动脉，穿过颈内和颈外

10、动脉分叉处进入颈内动脉。松开颈内动脉，继续将尼龙线插入到颈内动脉颅内段，当感到明显的插入阻力时，此时自颈内动脉起始部的插入长度约为2.0cm，表明线的头端已穿过大脑中动脉起始部。然后将颈外动脉残段用丝线结扎，以防插线脱落。大脑中动脉阻断后5h，观察动物有无脑缺血体征：提起鼠尾，左前肢内旋肩内收；置动物于光滑平面上，向健侧的推挡阻力减弱；左前肢肌力减弱。弃去无上述任何体征的动物。脑缺血后6h，断头处死动物，迅速取出前脑，冰上分离右侧皮层和纹状体，称重，加入1ml Tris-HCl(pH7.0)匀浆，用EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)10mmol/Triton X-100 0.5%液1ml稀释

11、，混匀，取40l用于胆碱乙酰化酶活性的测定。将动物分成9组进行实验：假手术(Sham)组，本组动物手术操作过程同上，但不插线；溶剂对照(Vehicle)组，分别于脑缺血后5和60min ip 0.5% Tween-80 1 ml.kg-1；dl-NBP 10mg.kg-1组；dl-NBP 20mg.kg-1组；d-NBP 10 mg.kg-1组；d-NBP 20 mg.kg-1组；l-NBP 10mg.kg-1组；l-NBP 20mg.kg-1组；尼莫地平(Nim)0.5mg.kg-1组。39组给药时间和次数同2组，每组56只动物。1.3皮层神经元的原代培养参考Choi方法2并略加修改。选14

12、18d的清洁级孕大鼠，100g.L-1的水合氯醛麻醉(400mg.kg-1，ip)。75%乙醇消毒腹部后，暴露腹腔。自子宫中取出胎鼠，倒T字型剪开颅骨，取下两侧皮层组织，于盛有DMEM培养基(含10%小牛血清，10%马血清，青链霉素各100u.ml-1)的小烧杯中用眼科剪剪成糜状，经吹打分散，200目细胞筛过滤后，以DMEM培养基将细胞浓度调至106ml-1，接种至预先用0.1g.L-1的多聚赖氨酸铺盖过的24孔培养板，每孔1ml，置二氧化碳孵箱(Precsion Scientific)中孵育24h后换液，以后每3d换液1次，于培养第7天，换以含10mol.L-1阿糖胞苷的DMEM培养基培养4

13、8h，以抑制神经胶质细胞的生长。换回正常培养基继续培养至第12天。1.4低糖低氧诱导的神经元损伤细胞培养至第12天，换以含各种药物预先用N2饱和的低糖培养基(含葡萄糖1000mg.L-1)，CO2孵箱中温孵10h后，吸出培养液后，每孔中加入0.2g.L-1 EDTA2-Na 0.5ml消化细胞15min，然后将细胞悬液收集在1.5ml的离心管中，冰冻保存备用。实验主要分以下3组进行：正常对照(Normal)组，细胞培养至第14天，换以正常高糖DMEM培养基(含血清)，温孵10h后，收集细胞。溶剂对照(Vehicle)组，低糖低氧环境，加入50mol.L-1的聚乙二醇 10l。给药组，细胞在低糖

14、低氧环境中培养10h并加入不同浓度的各种药物(dl-NBP，d-NBP或l-NBP)(浓度为0.110mol.L-1)。1.5NMDA诱导的神经元损伤细胞培养第14天，换以正常含血清DMEM培养基，每孔中加入10mmol.L-1 NMDA 10l，使其终浓度为0.1mmol.L-1，于CO2孵箱中孵育45min后，以0.2g.L-1EDTA-2Na消化细胞，冰冻保存备用。实验分组：正常对照(Normal)组，细胞培养至第14天，换以正常高糖DMEM培养基(含血清)，温孵45min后，收集细胞。溶剂对照(Vehicle)组，培养基中加入NMDA(N-甲基-D-门冬氨酸)和50ml.L-1的聚乙二

15、醇10l。给药组，NMDA损伤并加入不同浓度的各种药物(dl-NBP，d-NBP，l-NBP 0.1，1，10mol.L-1)或阳性对照药MK801 1mol.L-1。1.6胆碱乙酰化酶活性的测定胆碱乙酰化酶(ChAT)活性测定参照文献3以分光光度法进行测定。反应体系中含810-2mol.L-1磷酸缓冲液，1.0310-3mol.L-1乙酰辅酶A，0.17mol.L-1的氯化胆碱，1.5210-4mol.L-1甲基硫酸新斯的明，0.5mol.L-1 NaCl和1.710-4mol.L-1的EDTA-2Na。该混合体系于37温孵5min，加入40l样本后于37温孵20min，然后沸水浴中放置2m

16、in终止反应。冷却后加入适量氮气饱和的蒸馏水和1.710-4mol.L-1的4，4-二硫二 吡啶反应总体积为1.2ml。于室温中放置15min后记录在324nm处的吸光度。以体系中辅酶A的生成量作为衡量ChAT活性的标准。组织中ChAT活性以每毫克组织在反应体系中生成辅酶A的nmol表示；细胞中ChAT活性以每毫克蛋白在反应体系中生成辅酶A的nmol表示，以Lowry法测定蛋白含量。1.7统计学处理所有数据皆以s表示。各组间差异用方差分析(ANOVA检验)，两组间比较用t检验。2结果2.1对脑缺血后脑组织中ChAT的影响大脑中动脉阻断6h，缺血侧皮层和纹状体中ChAT活性显著降低，与假手术组相

17、比，分别下降了61.3%和58.4%，表明，脑缺血可致缺血区胆碱能神经功能受损。脑缺血后5和60min给dl-NBP 10或20mg.kg-1，可使皮层组织中ChAT的活性较缺血对照组分别提高53.7%和95.5%，纹状体中ChAT的活性分别提高58.6%和89.2%。经钙通道阻滞剂尼莫地平治疗后，亦可见皮层和纹状体中ChAT活性的降低明显减轻(1)。1丁基苯酞(dl-NBP)、及其左右旋体(l-NBP、d-NBP)和尼莫地平对大鼠局灶性脑缺血(6h)后大脑皮层和纹状体中胆碱乙酰化酶活性(以体系中辅酶A的生成速度表示)的影响。s,n=56。与假手术组比1)P0.01；与溶剂对照组比2)P0.0

18、5，3)P0.01观察d-NBP和l-NBP治疗后缺血脑组织中ChAT活性变化，发现二者对脑缺血所致的胆碱能神经损伤皆有一定的保护作用。经d-NBP10，20mg.kg-1治疗后，可见皮层组织中ChAT的活性分别提高至(3.251.12)和(3.760.40) nmol.min-1.mg-1(较溶剂对照组提高33.2%和54.1%)，纹状体中ChAT活性提高至(4.200.69)和(5.690.88)nmol.min-1.mg-1(较溶剂对照组提高61.3%和118.0%)。l-NBP 10，20mg.kg-1则分别将皮层组织中ChAT的活性提高45.9%(3.560.62)nmol.min-

19、1.mg-1和75.4%(4.280.34)nmol.min-1.mg-1，纹状体中ChAT的活性提高65.9%(4.330.68)nmol.min-1.mg-1和86.6%(4.870.79)nmol.min-1.mg-1(1)。2.2对低糖低氧诱导的神经细胞损伤后ChAT活性的影响原代培养的胎鼠皮层神经元于低糖低氧环境中10h，可引起明显的神经细胞损伤，ChAT活性显著降低。培养基中加入dl-NBP对低糖低氧所致的ChAT活性降低有明显的逆转作用，细胞液中ChAT活性较溶剂对照组分别提高2.1，2.7和3.4倍。但与正常对照组比较，给药组ChAT活性仍显著低于正常水平，说明dl-NBP对C

20、hAT活性的增加作用有一定的限度。低糖低氧的同时给d-NBP 0.1，1或10mol.L-1，可见神经细胞液中ChAT活性分别提高了1.8，1.8和2.8倍；给同样剂量的l-NBP后，低糖低氧损伤引起的ChAT活性降低亦明显减轻，ChAT活性分别较溶剂对照组提高1.3，2.3和2.7倍(表1)。表1丁基苯酞(dl-NBP)及其左右旋体(l-NBP、d-NBP)和MK801对经低糖低氧或NMDA处理(0.1mmol.L-1，45min)后原代培养的神经细胞内ChAT活性(nmol.min-1.mg-1)的影响.s,n=6组别药物浓度/mol.L-1损伤类型低糖低氧NMDANormal31.86.

21、935.76.8Vehicle02.31.61）4.22.11）dl-NBP0.14.83.26.82.82）16.22.92）9.24.32）107.83.23）16.76.63）d-NBP0.16.64.12）5.92.916.42.33）13.96.23）108.74.53）14.86.73）l-NBP0.15.23.68.23.72）17.74.52）12.24.83）108.44.13）15.96.73）MK801116.35.83）注：与正常神经元组比较，1)P0.01；与溶剂对照组比较，2)P0.05，3)P0.012.3对NMDA诱导的神经元损伤后ChAT活性的影响培养基中加入

22、NMDA后终浓度为100mol.L-1于CO2孵箱中温孵45min，可造成神经元的明显损伤，ChAT活性降至正常水平的1/8左右。NMDA损伤的同时，加入0.1，1或10mol.L-1的dl-NBP，可使ChAT活性提高至正常水平(35.746.82)nmol.min-1.mg-1protein的19.2%，25.7%和46.6%。同样条件下培养基中加入d-NBP 1和10mol.L-1后，亦可见ChAT活性明显增加，但d-NBP 0.1mol.L-1的作用不明显；而l-NBP在浓度为0.1mol.L-1时表现出对ChAT活性的明显提高作用。NMDA受体阻断剂MK801也可明显提高神经细胞损伤

23、后ChAT的活性。3讨论本实验结果显示，dl-NBP对局灶性脑缺血后脑组织中ChAT活性的降低具有明显的升高作用，表明dl-NBP对缺血后中枢胆碱能神经功能可能有一定的保护作用，此作用对于缺血性脑损伤后中枢胆碱能神经递质乙酰胆碱水平的维持具有重要意义，这可能是dl-NBP改善局灶性脑缺血后学习记忆功能的作用机制之一。dl-NBP对脑缺血后中枢胆碱能神经系统的保护作用可能是药物的直接作用而并非通过提高缺血脑组织的局部脑血流4，改善脑组织的血氧供应的继发性作用。其理由是d-NBP和l-NBP对局部脑血流的影响并不一致。研究表明，d-NBP可提高大鼠蛛网膜下腔出血后尾核脑血流，而l-NBP则无明显的影