P物质对变应性鼻炎动物模型鼻粘膜上皮短路电流的影响

1、            Effect of substance P on the short-circuit current of nasal mucosal epithelium 刘涛 杨平常 王斌全 张念祖 王长生 Liu Tao, Yang Pingchang, Wang Binquan, et al 【摘要】 目的 观察P物质（SP）作用于变应性鼻炎动物模型鼻粘膜引起的离子分 泌改变导致的上皮表面短路电流（Short-circuit current, Isc）的变化。

2、方法 以鸡蛋清蛋 白致敏大鼠后，用Ussing室技术测定鼻粘膜上皮表面短路电流。并观察神经激肽受体 （NK1）拮抗剂CP96345、组胺H1受体拮抗剂吡拉明、H2受体拮抗剂雷尼替丁和河豚毒素 对SP的阻断作用。结果 经SP刺激，致敏大鼠鼻粘膜表面Isc显著增高。经四种物质预 处理均能显著阻断SP引起的Isc变化。结论 SP经感觉神经末梢释放后，可引起上皮表 面离子电位变化、上皮通透性增高等一系列鼻粘膜病理变化。 【关键词】 鼻粘膜 P物质 鼻炎，变应性，常年性 河豚毒素 Effect of substance P on the short-circuit current of nasal mu

3、cosal epithelium Liu Tao, Yang Pingchang, Wang Binquan, et al. Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan, 030001 【Abstract】 Objective To observe the changes of epithlial apical membrane short-circuit current (Isc) of antigen-sensitized rat nasal muco

4、sa with the stimulation of Substances P (SP).Methods The epithelial apical membrane Isc were measured with Ussing chamber technique, and and we observed the blockage to the effect of SP by neurokinin receptor antagonist Cp96345, histamine H1 receptor antagonist pyrilamine, H2 antagonist renitidine a

5、nd neurotoxin respectively. Results The Isc increased significantly with the stimulation of SP. The effect of SP on Isc could be blocked significantly by pretreatment with four substances. Conclusion SP releasing from nervous endings plays the role on elicit a series of pathological changes like enh

6、anced Isc,epithelial permeabilities, etc. 【Key words】 Nasal mucosal Substance P Rhinitis, allergic, perennial Tetrodotoxin 鼻部变应性鼻炎导致的鼻粘膜功能改变包括鼻分泌物增多，血管和上皮通透性增高1、 粘膜肿胀等。引起这些改变的机理还没完全明了。由于肥大细胞和神经递质引起的鼻粘膜上 皮离子分泌的改变可能在其中有重要作用。我们采用经典的测定上皮离子电流（Isc）的Ussing 室技术，检测P物质(SP)作用于鼻粘膜引起的离子分泌变化导致的上皮表面Isc的改变。 材料和方法 一

7、、致敏动物 选用成年雄性、健康SD大鼠60只，体重200250 g，购于本校实验动物中心。致敏方 法：每只大鼠用1 mg鸡蛋清蛋白(EA, V级, Sigma 公司, 美国)加氢氧化铝凝胶为佐剂，腹 腔注射。另取百日咳杆菌毒素100 mg(Scalvo 研究所，意大利)腹腔注射，2周后重复注射 1次，然后每日在鼻腔滴同样浓度的鸡蛋清蛋白1次，连续5天2。 在取鼻粘膜标本的同时经心脏穿刺取血分离血清进行被动皮肤转移试验（PCA）3。 方法简述为：取健康大鼠60只，背部剃毛5 cm×5 cm，致敏大鼠血清稀释成164、1128、 1256、1512四种浓度，取0.1 ml皮下注射，8天后

8、经静脉注射EA抗原500 g（溶于0.5% 伊文思蓝溶液1 ml中），观察原注射致敏血清部位皮肤蓝色斑点的直径，大于5 mm定为阳性 反应，证实动物造模成功。PCA的滴度在1641512之间。实验前一日用EA抗原滴鼻，动 物出现用前爪挠鼻，发出“吭吭”声，前鼻孔有液滴等类似变应性鼻炎的临床表现。 二、Ussing室Isc测定装置和技术 Ussing室装置由A、B室、电极、电生理仪、电子计算机、37温水循环系统和氧气循环系 统组成。待测粘膜标本置于A室和B室之间的标本台上，上皮面朝向A室，标本台有一1.0 cm×0.6 cm 的通道连接A室和B室，粘膜标本横置于该通道中将通道完全隔断。

9、在A室和B室中加进37充氧 的Kreb缓冲液(配方为：NaCl 1.5, KH2PO4 2.0, MgCl2 1.1, CaCl21.25, NaHCO3 25, KCl 8, 单位为mmol/L)，每侧8 ml，A室的缓冲液中还含有10 mmol/L的甘露醇，B室缓冲液中还含有 10 mmol/L的葡萄糖。Ussing室的热水循环系统使缓冲液保持在37，给缓冲液持续充氧。 动物在深度麻醉下断头剖开鼻腔，迅速取下鼻中隔粘膜（包括鼻顶和鼻粘膜），平铺在 标本台上，上皮面朝向A室，标本台立即装配，在双侧Ussing室中加入缓冲液。双侧的鼻中隔 粘膜分别装于两套Ussing室装置，各种处理完全相同，

10、取其结果的平均值。 三、SP激发试验 鸡蛋清蛋白致敏的SD大鼠20只，分成4组，每组5只。按上述方法取鼻中隔粘膜装于Ussing 室装置，平衡15分钟，分别将不同浓度的SP加入A室的缓冲液中刺激鼻粘膜，使之终浓度分别 为10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，即每组动物接受其中一种浓度的SP刺激。由电子计算机持续记录Isc。 四、四种化学物质对SP的阻断作用的观察 取经鸡蛋清蛋白致敏的大鼠40只，分成A、B、C、D、E、F、G、H 8组，每组5只。实 验步骤同前。平衡15分钟后，分别用下列化学物质加进A室缓冲液中对标本进行预处理5分 钟，再加10-6mol/L的SP进A室中刺激，记录

11、Isc。预处理的化学物质(均购于Sigma公司)如下： A、B、C 3组分别用5×10-6、10-5、5×10-5 mol/L的NK1受体拮抗剂CP96345，D组用5×10-7mol/L 吡拉明，E组用5×10-6mol/L雷尼替丁，F组用10-6mol/L河豚毒素，G组用吡拉明联合河豚毒 素预处理，浓度同上。H组为对照组，不作预处理，仅用10-6mol/L的SP刺激。 结 果 在加各种刺激药物和拮抗剂之前，标本在Ussing室装置上平衡15分钟。在此期间记录 到的基线各组相同，平滑，无波动，示基线平稳。在A室加进SP从表面刺激致敏鼻粘膜，  

12、;                23分钟后Isc迅速增大，在1分钟内达到高峰，约持续3分钟下降到基线水平。10-8mol/L的 SP即可引起Isc增大，10-6mol/L使反应增到最大值，虽将SP浓度升高到10-5mol/L， Isc也不再继续增大(表1)。 表1 不同SP刺激致敏鼻粘膜引起的Isc(A/cm2) SP浓度(mol/L) 动物数 s 10-8 5 10.61 4.12 10-7 5 25.12 5.31 10-6 5 65.14

13、 6.66 10-5 5 60.48 5.45 C组动物用NK1受体拮抗剂预处理再用10-6mol/L的SP刺激，Isc和对照组比较显著减弱， 但未回到基线水平；组胺H1、H2拮抗剂预处理（D、E组），也分别部分地阻断了SP引起的 Isc升高；河豚毒素预处理（F组）对SP引起的Isc升高亦有显著阻断作用；用组胺H1受体拮 抗剂联合河豚毒素预处理（G组），对SP引起的Isc升高有更大的阻断作用，其阻断效果高 于前述任何一种阻断方法。分别用t检验对实验组和对照组的结果进行比较，差异都有显著 性 (表2)。 表2 几种化学物质与对照组比较使用10-6 mol/L浓度的对SP鼻粘膜Isc的差异 组别

14、动物数 s t 值 P值 A 5 21.34 3.34 13.97 0.001 B 5 17.36 4.15 14.34 0.001 C 5 14.56 3.39 16.22 0.001 D 5 32.14 4.56 9.29 0.001 E 5 41.49 5.38 5.96 0.001 F 5 21.42 3.03 14.27 0.001 G 5 10.12 2.19 19.29 0.001 H 5 62.23 5.63 G与D比较:t9.73, P0.001; G与F比较:t6.76, P0.001 讨 论 鼻粘膜中分布有丰富的神经末梢，大部分位于粘膜下层，但有一部分感觉神经末 梢穿过上

15、皮细胞间的紧密连接到达鼻粘膜表面，可接受鼻腔的物理、化学刺激。已有 报道，鼻粘膜中含有丰富的SP能神经纤维，鼻变应性疾病中时SP能神经功能增强4。 SP来源于感觉神经中的C类纤维，这些神经纤维和肥大细胞有密切联系，肥大细胞是变 应性鼻炎化学介质的主要来源。因此可以推测在变应性鼻炎中，鼻粘膜SP神经和肥大细 胞的相互作用的结果可导致上皮细胞离子分泌特性的改变，进而引起鼻粘膜上皮通透性 及分泌功能异常，导致一系列的生理、病理学变化。 正常人鼻粘膜上皮表面存在有离子电位，电细胞内外离子浓度差形成，主要涉及Na+、 K+、Cl-三种离子。在上皮细胞的吞噬活动和通透性增加时，Cl-从细胞内向细胞外运动增

16、 加，同时也有Na+的向细胞内运动，因而形成电化学电流和电位5。近年来人们注意到P 物质在鼻变应性疾病中的发病机理中有重要作用。已经发现变应性鼻炎患者血浆和鼻分泌 物中SP含量显著高于正常人4，用SP刺激鼻粘膜可以诱导出变应性鼻炎的临床表现，使 用辣椒辣素处理能使变应性鼻炎动物模型鼻粘膜中的SP含量减少，病变减轻。已有报道指 出，SP可以使呼吸道上皮或血管通透性增加6，系通过激动NK1受体途径引起。神经激 肽受体有NK1、NK2、NK3三种，SP可以和这3种受体结合，但亲和性最高的是NK17，因 此NK1受体在呼吸道变应性疾病中的作用已日益受到重视。研究结果表明，用SP刺激鼻粘 膜，使Isc迅

17、速增大，并呈正向量效关系，说明SP引起了上皮细胞离子分泌特性改变，提 示上皮的通透性等功能也发生变化8。经NK1受体拮抗剂预处理，SP引起Isc增大的作用 被显著阻断，进一步佐证了SP可能引起Isc增高并可能经与NK1受体介导有关。 用SP刺激粘 膜下层的神经元可以使之释放多种神经源性化学介质9，因而在本实验结果中，也可能 有SP的直接效果和由它刺激粘膜中神经组织释放的其它神经肽或神经递质的作用而产生的 间接效果。在使用河豚毒素预处理后，SP引起的Isc显著下降，说明其中有神经介导因素参与。 作者单位： 030001 太原 山西医科大学第一医院耳鼻咽喉科 参考文献 1Kawakuchi S,

18、Ukai K, Jin C, et al. Effect of histamine on nasal epithelial permeability to horseradish peroxidase in allergic guinea pigs. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1995, 104:394-401. 2Tanaka KL, Okamoto Y, Nagaya Y, et al. A nasal allergy model developed in guinea pig by intranasal application of 2,4-toluene di

19、isocynate. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1988,85:392-400. 3Aibara S, Mori M, Tsubaokawa M, et al. Antiallergic activity of 6-(2-cyclohexylethyl)-1,3,4 thiadiazolo-4，5-d pyrimidin-9(3H)-one(DS-4574) in rats. Int Arch Allergy Immunol, 1992, 98:146-152. 4Chaen T, Watanabe N, Mogi G, et al.Substance P and vasoactive intestinal peptide in nasal secretions and plasma from patients with nasal allergy. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1993, 102: 16-21. 5Chinet TC, Fullton JM, Yankaskas JR, et al. Sodium-permeable channels in the apical membrane of human nasal e