应用寡核苷酸芯片进行HLADQA1位点基因分型

1、百度文库-好好学习.天天向上应用寡核甘酸芯片进行HLA-DQA1位点基因分型作者：王彤，王天骄，何群，张玉魁，马佳明，侯伟建，王绍成，潘忠诚，赵雨杰【摘要】为了构建HLA-DQA1位点寡核甘酸分型芯片并籍此建立一种应用于HLA系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域，自行设计一套寡核苜酸分型探针；采用本实验室自建的方法，制成寡核甘酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号，确定HLA等位基因型；分型结果以标准DA和PCR产物测序检测。结果表明：100例样本芯片分型全部成功，其中50例标准DXA与其模板

2、相符,另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符，其中2例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率95%。结论：研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。【关键词】基因分型HLA-DQA1GenotypingbyUsingOligonucleotideMicroarraysAbstractInordertofabricatetheHLA-DQA1genotypingchipanddevelopanintegrated,paralleltechnicalplatformtotypeHLAsystem,apairofprimersa

3、ndasetofprobesweredesignedaccordingtothesequencesofHLA-DQA1exon2,wherethepolymorphismisconcentrated.Theoligonucleotidechipwasmadewiththemethodsdevelopedinourlaboratory.ThetargetDNAwasasymmetricallyamplifiedwiththelabeledsenseprimer.Thesignalswerescannedandanalyzedafterthehybridizationbetweenmicroarr

4、ayandPCRproduct.Thealleletypesofthesampleswereidenlified.TheresultwasverifiedbythestandardDXAandDNAsequencing.Theresultsshowedthatthegenotypingwassuccessfullycarriedoutin50standardDXAsamplesand50clinicalsamples.Amongthem,resultsofthe50standardDNAsamplesmatchedtheirtemplates.Intheother50samples,resul

5、tsoftherandomlyselected10matchedtheirsequencingresultsexceptthattwoofthemgottheincompletelyresult.Inreproducibletests,thesignalreappearratewas95%.ItisconcludedthatHLA-DQA1genotypingbyusingourarraysystemissimpleandconvenientwithsatisfiedaccuracyandreproducibi1ity.KeywordsHLA-DQA1；genotype；oligonucleo

6、tidechip组织配型的情况是影响器官移植成活率的关键因素，同时，特定的HLA基因座位还和某些疾病相关联，因此HLA的分型工作亦受到广泛重视。到目前为止，国内外的HLA的分型研究仍多集中于A、B、DR位点。近年来，组成较为复杂的II型位点因与疾病有较多关联而多有报道。其中DQ位点与扩张性心肌症1,病毒性乙型肝炎2,糖尿病3,4,银屑病5等多种疾病的罹患率及预后相关。1996年，HLA-DQ也被定义为移植抗原6o目前，HLA分型有血清学分型和基因分型，后者更具优势和发展前途。对基因分型国际上推荐使用PCR-SSP和PCR-SSOP方法，但两者在设计或操作上略显繁琐。基因芯片的问世为HLA分型工

7、作提供了新的思路，基因芯片的高通量、集成化和并行检测等优势使其极为适用于复杂的HLA遗传系统。国内外在这方面的报道很多，但尚没有成熟的分型产品问世，也未见临床大规模应用的报道。本研究使用自行构建的寡核仃酸芯片(oligonucleotidemicroarrays),对HLA-DQA1位点进行基因分型检测，旨在建立一套成熟的分型技术，用于复杂的HLA系统的分型研究。-3百度文库-好好学习.天天向上材料和方法DNA样本50例临床样本采自中国医科大学附属第一医院，50例标准DNA样品由中国刑警学院法医系法医学教研室提供7o主要试剂及仪器手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(Sigma公司)，P

8、CR试剂盒及相关试剂(Promega公司),蛙鱼精DXA(Sigma公司),其他化学试剂均为分析纯。PCR扩增仪(BiometraPersonalPCRsystem,USA),生物芯片点样仪(MGII600,BioRobotics,England),激光共聚焦扫描仪(GeneTACTMLSIV,GenomicSolutionsInc.USA)引物及探针根据GenBank数据库新近公布的HLA-DQA1等位基因序列，在多态性集中的exon2保守区及变异区分别设计1对引物及16条特异性分型探针，交由上海生物工程公司合成，并在正义链引物5'端作FITC标记，序列如下：Pl(+)Exon2:5

9、'-TGTATTACATGGGMTATGTGATTTTAGA-3'；P2(-)Exon2:5'-CAGGGGTTGGAAATGTCCAC-3*,并在各探针5'端做氨基修饰。各组探针的序列见附表。全血基因组DA的提取改良的酚/氯仿法：1ml抗凝的外周血,896Xg离心5分钟,分离中层白细胞后，传统酚/氯仿/异丙醇法8抽提DNA,-20保存。PCR扩增与产物标记扩增体系20U1,含基因组DNA1口1。以组间特异性引物,行1：20不对称扩增。扩增条件965分钟，9630秒，5940秒，7240秒，35个循环。产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。载片制备本室自建流

10、程。市售玻片(20mmX20mm)于铝酸溶液中浸泡12小时以上，蒸储水洗净，INNaOH浸泡1小时，丙酮化3分钟。浸入手臂分子溶液(2%氨基丙基三乙氧基硅烷，以95%丙酮溶解)10分钟，丙酮清洗，104烤干后，5%戊二醛中浸泡过夜。寡核甘酸微阵列的制备以预先摸索好的条件，将16条寡核苜酸探针以探针缓冲液重悬至80Umol/L,与同等浓度的阳性对照探针（全序列匹配的反义链引物）、阴性对照无关探针（与目标序列同源性低于50%）、空白对照探针缓冲液，共同加入384孔板。启动生物芯片点样仪，制成预先设计好的微阵列。点样中注意保湿，点样后37水化过夜，80烤干，备用。Table.Probesequenc

11、es（略）封闭与核酸杂交按本室方法90取制备好的寡核苜酸芯片，用前以SDS洗去多余的未共价结合的探针。浸入5%二乙胺（MPB,pH=9）,室温封闭30分钟，充分洗净吹干。PCR产物加杂交液（鞋鱼精DNA10ug/ml）按1：1稀释混匀，取8U1覆盖于各微阵列，加放硅烷化盖片。置入湿度适宜的杂交舱中55c保温30秒。洗涤与检测分析取出杂交芯片，冲去盖片。用预热至60c的洗液（IXSSC/%SDS,XSSC/%SDS,XSSC）行梯度洗涤，用ddH20洗净，吹干。使用激光共聚焦扫描仪检测，CCD成像软件分析杂交信号，确定样本的基因型。结果基因组DNA的获取及靶基因的扩增基因组DXA的浓度为100-

12、200ng/uloA260/280值1,纯度均>50%。PCR产物经PAGE检测，可见扩增条带清晰，特异性理想，对称产物长度538bp,与设计相符。寡核甘酸芯片的分型100份样品分型全部成功。其中50份标准样品分型结果与其模板全部相符。另50份临床血样随机抽取10份进行PCR产物测序,2份分型结果不完全相符（测序确定其为复合型，分别为0301/04,04/06；基因芯片分型为单纯型，即0301,04）,另8例正确。图A,B,C示1例选择测序的临床样本。分型结果的稳定性为验证芯片的稳定性及重现率，随机选取10份样品重复5次杂交实验。16个分型位点中，2份样品完全重复，3份可重复15

13、个分型位点，5份重复14个分型位点。重现率95%。HLA复合体遗传区位于，长约3600kb,约占人类基因组总长度的1/3000。第十三届国际组织相容性专题会议确定已发现的HLA等位基因达到1340个。HLA血清学分型多用微量淋巴细胞毒实验，在20世纪80年代中期之前是HLA研究的重点，其检查I类抗原经济有效，但在检测U类抗原时却遇到了困难：一方面II类抗原在未激活T细胞上不表达，需分离纯化B细胞；另一方面I1类抗原多由双座位等位基因构成复杂的多态性，使得准确判定相应等位基因产物的抗原特异性十分困难。Opelz等10曾将来自58个移植中心的4000份冰冻组织标本进行回顾性分析，发现血清学方法分型

14、HLA-A,HLA-B错误率4%,而HLA-DR分型错误率高达25%。因此II类抗原多不采用血清学分型。目前，HLA基因分型国际上推荐使用PCR-SSP和PCR-SSOPoBunce等11用188个引物，经144次PCR建立一步法PCR-SSP,成功地对HLA-I、II类所有抗原进行了分型。该方法特异性较高，但主要依赖于PCR技术，操作略显繁琐，且结果分析非常复杂。PCR-SSOP因具有灵敏度高、误差率小、样本量少的优点，是现今国内外分型应用最多的方法。但该法选择的支持介质是膜12或微滴定板13,对于HLA复杂的等位基因，不具有集成化的优势。基因芯片作为“20世纪影响最为深远的科学技术手段之一

15、”，非常适合分型复杂的HLA系统，已引起众多科研机构的关注。但各家在制作分型芯片时方法差别相当大，表明基因芯片的技术流程还需要标准化。国际上对实质性器官移植通用“六抗原无错配"标准，即HLA-A>-B、-DR在供受者中无错配，记为“0AgMM”14。而HLA-DQA1,-DQB1及-DRB1的连锁不平衡导致在限定人群中产生预期的抗原系。如大多白种人供受HLA-A、-B、-DRB1匹配者，HLA-DQB1及HLA-DQA1也同样匹配15。本研究所采用的HLA-DQA1位点的探针组合，尚属中等分辨率检测，若进行高分辨率检测，还需要设计更多的探针及进行探针的优化。而HLA基因分型的要

16、求则视用途而定，就临床实质性组织器官移植而言，采用中分辨率的分型条件是最佳选择。因高分辨度将增加分型所需的时间和费用，且不易寻找到匹配的供者。但法医学上的个人鉴定则不同，确定唯一的等位基因型是其目的。本室研制的寡核甘酸芯片制作相对简单，易于操作，且稳定性好，特异性和灵敏度都能满足基因分型的需要，故适合器官移植前的组织配型及疾病相关基因型检测等临床应用。在多次实验中，体会到探针连接，即水化的步骤至关重要，它对实验结果影响很大。水化过程中应注意保湿，且湿盒内要保持合适的盐溶液浓度。另外，杂交信号的强度与PCR扩增后的电泳条带似无明显相关。当某些原因造成PCR产量不足，或扩增条带特异性不理想时，对杂

17、交信号强度及特异性并无明显影响。这在理论上一方面归因于碱基之间严格的互补配对，另一方面归因于芯片通过二级放大获得的高灵敏度。同时，有效而适宜的背景封闭可降低背景亮度，间接提高信噪比。【参考文献】ILiuW,LiWM,SunNL.RelationshipbetweenHLA-DQA1polymorphismandgeneticsusceptibilitytoidiopathicdilatedcardiomyopathy.ChinMedJ,2004；117:1449-14522ZangGQ,XiM,FengML,etal.Curativeeffectsofinterferon-aandHLA-DR

18、B1-DQA1and-DQB1allelesinchronicviralhepatitisB.WorldJGastroenterol,2004；10:2116-21183罗佐杰，粱杏欢，粱敏等.HLA-DQA1基因与广西地区壮族、汉族2型糖尿病关联性研究.中华内分泌代谢杂志,2004；20:425-4274张冬梅，周智广，张弛等.应用HLA-DQ基因型对自身抗体阴性1型糖尿病的再分型.中华内科杂志，2004；43:174-1785ZhengGY,WeiSC,ShiTL,etal.Associationbetweenalcohol,smokingandHLA-DQAI*0201genotypei

19、npsoriasis.ActaBiochimicaBiophysSin,2004；36:597-6026PetersdorfEW,LongtonGM，AnasettiC，etal.DefinitionofHLA-DQasatransplantationantigen.ProcNatlAcadSciUSA,1996；93:7张璐，李树，巴华杰等.中国五个民族HLA-DQA的PCR多态性.中国刑警学院学报,2004；4:50-51SKramvisA,BukofzerS,KewofhepatitisBvirusDXAextractionsfromserumbytheQIAampbloodkit,GeneRelea-ser,andthephenol-chloroformmethod.JClinMicrobiol,1996；34:2731-27339何群，赵雨杰.一种新的DNA芯片的封闭方法.遗传,2004；26:361-363lOOpelzG,MytilineosJ,SchererS,etal.SurvivalofDNAHLA-DRtypedandmatchedcadaverkidneytransplants.Lancet,1991；38(8765):461-463UBunceM,O'NeillCM,BarnardoMC,etal.Phototyping:comprehen