广枣总黄酮对小鼠胸腺细胞凋亡及腺苷脱氨酶(ADA)活性的影响

1、    广枣总黄酮对小鼠胸腺细胞凋亡及 腺苷脱氨酶(ADA)活性的影响        【摘要】目的 研究蒙药广枣总黄酮（TFC）对地塞米松（DEX）诱导的小鼠胸腺细胞调亡及胸腺细胞内腺苷脱氨酶（ADA）活性隆低的免疫调节作用。方法 将小鼠分为DEX组、TFC组、TFC+DEX组和正常对照组，采用光镜(计凋亡率，数据经方差分析)、电镜(形态学观察)。DNA琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度比色法(吸光度值经t检验处理)在培养3，6，9，12，24小时动态观察下，研究TFC对

2、胸腺细胞凋亡及ADA活性的影响。 结果在不同的培养时间均看到TFC抑制DEX诱导的胸腺细胞凋亡(P<0.01)及TFC的促胸腺细胞分裂、增殖现象，但TFC对细胞培养产生的自发凋亡似无抑制作用(P>0.05)；TFC可促进胸腺萎缩小鼠的胸腺细胞内ADA活性恢复(P<0.01)。 结论TFC有提高机体免疫功能作用，这对临床上应用糖皮质激素导致的免疫缺陷、重症感染及肿瘤等的治疗提供了实验依据。【主题词】广枣黄酮胸腺细胞凋亡腺苷脱氨酶 Effects of total flavones of choerospondias axillaris (TFC) on thymocyte ap

3、optosis and ADA activation of miceLi Bin,Tian Guocai,Lin Na,et al.Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital,Mongolian Medical College,Huhehot 010059【Abstract】Objective Dexamethason is a common immunosuppressant.It can induce immunodeficinency in the patients who take it for a long time,the

4、 causes of which have been proved due to mainly thymus atrophy,originally thymocyte apoptosis as well as ADA activity lowered. TFC is a Mongolian traditional drug that can promote the cell-mediated and humoral immune responses.In order to study the effect of TFC on dexamethason induced thymocyte apo

5、ptosis in mice and the influence of TFC on ADA activity in the thymocytes. MethodsThe thymocytes were incubated respectively for 3,6,9,12 and 24 hours with dexamethason,TFC,dexamethason+TFC.The cells of apoptosis were observed with aptical the microscope for counting the proportion of apoptosis and

6、the data treated with analysis of variance,and the electronic microscopy for morphology,DNA agarose gel electrophoresis and ADA activity was detected with spectrophotometer(A value treated with t-test). ResultsThe results showed that TFC could inhibit dexamethason-induced thymocyte apoptosis (P<0

7、.01) and promote proliferation differentiation of the thymocytes in different periods.But TFC could not inhibit natural apoptosis of the incubated cells(P>0.05).In addition,TFC also could facilitate the restoration of ADA activation of the thymocytes in the thymus astrophy mice.ConclusionIt can b

8、e seen that TFC can promote the immune responses of the body,which provides a powerful evidence for the treatment of immunodefiency,serious infections and tumors induced by the application of gluco-corticoid hormone in the clinic.【Subject words】ThymocyteApoptosisFlavones choerospondias axillarisAden

9、osine deaminase细胞凋亡(Apoptosis or program cell death)是多细胞动物发育、成熟、生命过程中所不可或缺的细胞事件，机体组织是通过细胞增殖与凋亡的平衡使机体维持正常结构与功能的生理性死亡过程。同样，细胞凋亡参与胸腺细胞阴性选择，免疫耐受和维持正常免疫功能等。广枣为漆树科植物Choerospondias axillaris (Roxb)Burtt et Hill的成熟果实，蒙医用以主治心悸不安，有行气活血，养血安神的作用1。近年来，本室研究和报道的资料表明，广枣总黄酮(TFC)有增强免疫的作用2，可提高小鼠胸腺细胞增殖率及增强细胞水解酶和脱氢酶活力3。

10、但TFC对胸腺细胞凋亡及对胸腺细胞ADA活性的影响，尚无报道。本研究应用光镜、电镜形态学检查和DNA琼脂糖凝胶电泳技术研究了TFC对体外培养细胞自发的和DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡以及DEX致胸腺萎缩小鼠胸腺细胞内ADA活性及胸腺重量的影响，为阐明TFC的免疫调节和临床应用提供理论和实践依据。材料与方法1.实验动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重(16±2)g，由内蒙古大学实验动物中心提供。2.主要试剂：地塞米松磷酸钠(DEX，江苏兴化制药厂)；蛋白酶K(Sigma公司)；RNase A (SABC); DNA/EcoR+Hindmarkers(华美生物工程公司)；腺苷(adenosin

11、e,Sigma公司)。3.药物：广枣总黄酮注射液(total flavones of choerospondias injection),由内蒙古中蒙医研究所药物室提供。4.小鼠胸腺细胞凋亡检测(1)胸腺细胞培养：将新鲜制备的107/ml胸腺细胞6ml加入各平皿中，分4组：正常对照组(I)；地塞米松组()，终浓度为10-5mol/L；10-5mol/L DEX+40g/ml TFC组()；TFC组()，浓度为40g/ml(以上各有效剂量均为预试所确定)。然后置5% CO2培养箱中，37分别于培养后3，6，9，12，24小时取出，离心，收获细胞备用(在观察TFC本身对小鼠新鲜胸腺细胞无毒害作用后

12、做本试验)。(2)光镜检查：按Gavrieli4等方法操作。将胸腺细胞中加入甲醛，室温下固定10分钟，放一滴于APES薄片上，晾干后HE染色，油镜下计数500个细胞，并计数其中凋亡的细胞数，以计算凋亡率。(3)电镜检查：将收获的胸腺细胞按常规方法制备，超薄切片制作标本，电镜观察(放大4800倍)。(4)DNA片段提取及电泳测定：采用Facchinetti5等方法。简言之，将胸腺细胞加5倍体积裂解液，50水浴1小时后，以酚，氯仿/异戊醇抽提，DNA溶液中加氯化镁乙酸钠混合液和无水乙醇，-20过夜。离心后向沉淀中加入70%乙醇，洗涤后溶于TE中，再加RNase A及蛋白酶K，50 水浴过夜。于含溴

13、乙锭的 1.8%琼脂糖凝胶中电泳1.5小时，电压60V，紫外灯下观察DNA梯状带(DNA ladder)并照像。5.小鼠胸腺细胞ADA活性及胸腺重量测定(1)实验分组及胸腺重量测定：随机将昆明鼠(雌雄各半)240只分3组，每组80只。组为正常对照组；组为地塞米松组，腹腔注射地塞米松100g；组为DEX+TFC组，腹腔注射DEX(100g)1小时后，再注射TFC(2500g)，连续10天。并每日、组各杀8只，分别测小鼠重量，胸腺重量，并制成107/ml胸腺细胞悬液备用。(2)胸腺细胞内ADA活性检测：将胸腺细胞液离心，弃上清，沉淀中加双蒸水，在超声粉碎机上破坏细胞，离心，吸上清液，按文献6方法，

14、在260nm紫外分光光度下比色，测胸腺细胞内ADA吸光度(A)值。结果1.TFC体外对DEX致小鼠胸腺细胞凋亡的影响(1)电镜观察：均为体外培养6小时电镜(4800倍)所见。组细胞形态正常(1A)；DEX组(组)胸腺细胞变圆，体积缩小，胞浆浓缩，核染色质浓集于核膜周边，形成凋亡小体和空泡等，但细胞膜本身完整呈典型的凋亡的形态(1B)；组(DEX+TFC)大部分胸腺细胞形态正常，一部分呈分裂、增殖像，少数细胞呈凋亡的形态(1C)；组(TFC组)可见到明显分裂增殖像(1D)。1TFC对小鼠胸腺细胞凋亡作用的形态学特征(放大4800倍)Fig 1. Morphologic characterizat

15、ion of apoptosis in murine thymocytes(4800×)A：Normal control, B:Thymocytes+DEX,C:Thymocytes+DEX+TFC, D:Thymocytes+TFC(2)细胞凋亡率比较：光镜下4组体外培养细胞凋亡率动态观察表明，DEX诱导的细胞凋亡在培养3小时即出现，随培养时间延长至24小时4组均出现凋亡。但各组曲线型不一，组呈直线上升；组则于9小时前呈直线升高，之后趋于平稳，远低于组(P<0.01),而、组细胞凋亡率曲线相近(2)。试验证明，TFC有抑制DEX致胸腺细胞凋亡的作用，但对细胞培养产生的自发凋亡

16、，似无明显抑制作用。2胸腺细胞凋亡率曲线Fig 2. The curve of apoptosisThe thymocytes were incubated with DEX(10-5mol/L)();DEX(105mol/L)+TFC(40g/ml)();or TFC(40g/ml)() as control()(3)DNA琼脂糖电泳结果：在培养6小时时，组(DEX)DNA电泳后呈典型的“阶梯状”(ladder)条带，与标准分子量DNA参照物比较，DNA裂解为不连续的180200bp整数多倍体的DNA片段，、组均未出现“阶梯带”(3A)；培养12小时时，组(DEX)、组(DEX+TFC)均出

17、现“阶梯带”(3B)；培养24小时时，4组均出现典型“阶梯状条带”，提示有自然凋亡发生(3C)。试验证明，TFC在体外可早期抑制DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡，而对细胞自发凋亡无明显影响，并且这一所见与2结果一致。 3TFC对体外培养不同时间的小鼠胸腺细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳分析Fig 3. Effect of TFC on apoptosis in murine thymocytes at different times by DNA agarose gel electrophoresis The thymocytes were incubated for 6 hours (A);12

18、hours(B) and 24 hours(C)Lane 1:Cultured thymocytes(); Lane 2:DEX(10-5mol/L)();Lane 3:TFC(40g/ml)(); Lane 4:DEX(10-5mol/L+TFC(40g/ml)(); Lane 5:Markers(4)TFC抑制凋亡的剂量依赖关系：在TFC抑制凋亡的试验中，我们曾试验过TFC的5种剂量，即终浓度分别为8.3g/ml(50g/6ml);25.0g/ml(150g/6ml);41.6g/ml(250g/6ml);83.3g/ml(500g/6ml),最后又试用40.0g/ml(240g/6ml)

19、。从光镜计凋亡率及DNA电泳结果中均显示出，TFC 8.3g/ml及 25.0g/ml不能抑制凋亡，而TFC40g/ml, 41.6g/ml与83.3g/ml均可抑制凋亡；并且TFC 40g/ml与83.3g/ml剂量在对凋亡的抑制程度上无显著差异(P>0.05)，所以本试验选定的TFC剂量为40g/ml。2.TFC体内对免疫缺陷鼠胸腺细胞内ADA活性及胸腺重量的影响：我们在给小鼠腹腔注射13天内，可见到DEX(组)及DEX+TFC(组)小鼠胸腺细胞内ADA活性明显下降，达最低值。组ADA活性于第4天开始升高，以后呈锯齿形上升，于第10天时，ADA活性仍未达正常水平。而组从第5天开始AD

20、A活性逐渐恢复，也呈锯齿形上升，但第310天间，组小鼠胸腺细胞内ADA活性显著高于组(P<0.01)(4)，说明TFC对DEX所致免疫缺陷鼠胸腺细胞内ADA活性的恢复有明显促进作用。但胸腺重量在给药后组及组均同时降低，从第69天、两组胸腺重量均开始逐渐恢复，两曲线平行上升(P>0.05)，第10天时，组小鼠胸腺重量明显增加，并接近正常，在此剂量范围内未见TFC有抗DEX造成的胸腺萎缩作用(5)。4TFC对小鼠胸腺细胞ADA活性作用Fig 4. Effect of TFC on ADA activation in murine thymocytes:Normal control; :

21、DEX(100g); :DEX(100g)+TFC(2500g)5TFC对小鼠胸腺重量影响Fig 5.Effect of TFC on weight of murine thymus:Normal control; :DEX(100g); :DEX(100g)+TFC(2500g)讨论细胞凋亡是细胞在基因控制和一定的生理或病理条件下遵循自身规律，有程序地自己结束其生命的死亡。本文从光镜、电镜下呈现出典型的形态学和DNA片段的生化特征说明，在体外用地塞米松诱导了胸腺细胞的凋亡，同时证实了TFC对小鼠胸腺细胞有明显促增殖作用。此外，在TFC与DEX共同加入胸腺细胞培养时，首次发现，TFC有明显抑制

22、DEX诱导胸腺细胞凋亡的作用，从而表明TFC有调变细胞免疫缺陷的功能。根据Grassilli等7报道，在APO与细胞增殖间存在着深奥的关系。已知锌之阻断DEX诱导的胸腺DNA断裂是通过它促进RNA、DNA合成导致T、B淋巴细胞分裂增殖所致8。本研究证实了TFC在体外促进小鼠胸腺细胞增殖，同时也具有抑制DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡的作用，提示广枣具有免疫调节功能。有关TFC此两种不同的作用机制尚不清楚，鉴于bcl-2能在多种正常细胞激活后和发育中表达，并且bcl-2表达可抑制多种细胞凋亡9，10，胸腺细胞多为不成熟T细胞，所以当TFC激活胸腺细胞使其增殖后可促进bcl-2表达，以致专一性地抑制由许

23、多刺激因素(包括DEX)所诱导的凋亡。提示TFC似与丝裂原和生长因子等免疫增强剂作用相同。因此，我们推想，TFC抑制细胞凋亡可能的机制主要与其促进细胞分裂、增殖有关。ADA是嘌呤核苷酸分解代谢过程中的关键酶，以淋巴细胞中活性最高，T淋巴细胞比B淋巴细胞活性更高。当ADA缺乏或活性受抑制时，能引起腺苷积聚，干扰内源性嘧啶合成，从而对淋巴细胞有毒性，还可引起脱氧腺苷积聚，导致脱氧三磷酸腺苷(dATP)堆积，因而干扰DNA合成，所以淋巴细胞中ADA活性改变直接影响免疫功能。近年来发现在伤寒、结核、重症联合免疫缺陷病、肿瘤、SLE等均有淋巴细胞ADA活性降低的报道，因此ADA活性成为反映机体细胞免疫功

24、能的一个重要指标。小鼠体内注射DEX后其胸腺重量及胸腺细胞内ADA活性明显降低，但在腹腔注射DEX后再注射TFC，尽管在实验期内未见其明显抑制DEX造成的胸腺萎缩，但却能促进胸腺细胞ADA活性的恢复，有提高细胞免疫功能的作用。鉴于糖皮质激素可体外诱导小鼠胸腺细胞凋亡，同时能降低胸腺细胞的ADA活性，根据实验，TFC能抑制前者的凋亡和促进恢复后者所致的ADA活性，以提高机体免疫功能，这对临床上应用糖皮质激素等导致的免疫缺陷和重症感染、肿瘤等的治疗，提供了有力的实验依据；亦拓宽了蒙药广枣总黄酮的传统应用范围，开辟了蒙药的应用前景。作者单位：010059 呼和浩特，内蒙古医学院一附院儿科李嫔(硕士研

25、究生)，崔淑兰；内蒙古医学院微生物、免疫学教研室(田国才，林娜)；呼和浩特铁路局生卫处(及金宝)参考文献1邓丽嘉，王月梅，顾维彰.蒙药广枣化学成分研究.中草药，1989，20(3)8-9.2王玉珍，任建梅，王若愚.广枣总黄酮对小鼠免疫功能的影响.中国药理学通报，1991，7(3)214-217.3Tian Guocai,Liu Zhao,Li Lanyin,et al.The influence of fructus choerospondias on the cytochemical reaction and proliferation response of thymocytes in mice.Chin J Histochem Cytochem,1993,2148-149.4Gavrieli Y,Sherman Y,Shmuel A,et al.Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119(3)493-501.5Facchinetti L,Tessarollo M,Mazzocchi R,e