学习手册-细菌的分离

1、学习手册子情境：微生物的菌种选育-细菌的分离引导文-单元设计-技能考核标准-实训指导书子情景：引导文微生物的菌种选育-细菌的分离阅读材料 细菌的分离在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落

2、，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。细菌分离的目的是什么？材料一：细菌分离的方法根据待分离样品经不同方法处理后得到的菌悬液中所含有所需地微生物的浓度以及生理生化特性，选则适宜的分离方法。纯种分离方法有平板划线法、简单平板分离法、稀释倾注分离法、涂布分离法、毛细管分离法、小滴分离法以及显微操作单细胞分离法。微生物分离有哪些方法？材料二：平板划线分离法在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。因此，平板划线法一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区

3、的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。 平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。常用的平板划线分离法有以下两种： 图4-1连续划线法 图4-2分区划线法1. 连续划线分离法：图4-3 划线分离示意图以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多

4、余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成3040度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。此法主要用于杂菌不多的标本。用接种环取标本少许，于平板1/5处密集涂布，然后来回作曲线连续划线接种，线与线间有一定距离，划满平板为止。2.

5、 分区划线分离法：本法适用于杂菌量较多的标本。取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动6070度。灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约6070度，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，

6、关上皿盖，倒置于37恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。材料三：鉴别培养基鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数）其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。材料四：大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌的分离 一、原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不

7、同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。 平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离

8、菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。二、材料和器皿 1、菌种：大肠埃希氏菌(Escheric

9、hia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的混合培养斜面菌种。2、培养基：伊红美蓝琼脂培养基。 3、器皿：无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。作用能力均小于对可溶性淀粉的作用能力, 估计作用能力均降低与酶对底物作用的Km 值上升有关。三、操作步骤1、 融化培养基 将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。2、 倒平板待培养基冷却至50左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝。操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口

10、的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。3、 作分区标志（操作熟练后此步骤可省略）在皿底用记号划分成4个不同面积的区域，使A<B<C<D，且各区的夹角应为120°左右，以便使D区与A区所划出的线条相平行、美观。（图1）4、划线操作 1 挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。 2 先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划34条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环

11、上的残余菌样。 3 划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区(菌源区)而移至B区，随即在B区轻巧地划上67条致密的平行线，接 着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行(但不能与A区或B区的线条接触！)，最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。 5、 恒温培养将划线后的平板至37倒置培养23天。6、 挑单菌落良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。7、 清洗培养皿 将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、

12、晾干。 四、注意事项 1、 平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。 2、 用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。 3、 用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。 4、为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。 2、 思考题 1、用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？有何优点？ 2、要防止平板被划破应采取哪些措施？ 3、为什么

13、在划完A区后要将环上的残菌烧死？划后面几区时是否也要经过同样的处理？材料五：无菌技术（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。（2） 消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、红外线消毒。灭菌则是指使用强

14、烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。微生物的菌种选育-细菌的分离 学习情境设计方案学习领域课程名称食品应用微生物基础总学时72学习情境名称微生物的菌种选育-细菌的分离使用学时4学习目标1.知识目标l 掌握平板划线分离微生物的原理l 掌握平板划线分离微生物的基本方法l 掌握平板划线分离微生物的基本操作l 掌握鉴别培养基的选则和使用l 掌握无菌操作技术2.能力目标专业能力l 能熟练倾倒平板l 能熟在皿底做分区标志l 能熟练用接种环挑取少量含菌试样l 能熟练在不同分区进行平板划线l 能熟挑选单菌落l 能熟练进行无菌操作方法能力l 阅读操作

15、标准的能力l 动手实施能力l 创新能力l 自主学习新技术、新知识的能力l 分析问题、解决问题的能力社会能力l 团队工作能力。l 与人沟通能力。l 工作安全和保护能力3.素质目标l 培养规范意识l 树立严谨、科学的态度l 加强安全意识教学内容及组织过程教学方法l 1.微生物分离的目的l 2.微生物分离的基本方法l 3.平板划线分离的基本原理l 4.平板划线分离的基本操作l 5.单菌落的挑选l 6.无菌操作宏观教学法：引导文教学法任务组织（30分钟）分配任务，发放引导文；组织几个学习小组；每组各选出一名组长讲述法、头脑风暴，参观法、引导问题法、文字处理标识、事故案例法任务策划（20分钟）根据各自学

16、习，通过讨论等方式，确定糖化酶活性测定的实施方案。讨论法、可视化报告法、互动交流教学法产品试制（200分钟）根据细菌分离方案，教师参与大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌分离的实施过程。在方案实施过程的每个环节中，实施者要始终对无菌操作保持高度重视，其次要注意平板不能倒的太薄，平板划线时不能划破平板，最后能找到单菌落。这个过程中师生共同分析、解决细菌分离 中遇到的问题。角色扮演法、小组合作、取长补短法、仿真训练法任务评价（20分钟）各组成员对倒平板、接种环取菌、分区平板划线、挑取单菌落及无菌操作等情况进行评价；各班组成员对任务的组织、策划、实施等过程进行自评和互评；教师就各组成员在不同阶段的个方面的表现

17、情况进行评价；教师根据各各小组学生平板划线过程中出现的情况提出问题，学生通过讨论方式尝试给出解释方法，教师总结归纳解决方法。交互评价法、旋转交换讨论法、教师归纳法教学环境与资源：1.生物发酵实训室2.模仿仿真生物实训室3.校级精品课网站资源教师知识与能力要求：l 掌握微生物分离技术的基本概况l 掌握微生物分离的基本方法。l 掌平板划线分离方法。l 掌平板划线法操作技术。l 掌判断、挑取单菌落方法技术。l 掌握微生物无菌操作技术。学生知识与能力准备：l 具备查阅资料等基本技能l 阅读生产工艺能力l 一定的动手能力l 一定自学能力和分析问题能力评价形式考核评价：评价方式：过程性评价作业考核评价内容

18、：过程评价指标基础知识问题备注：学生通过整个任物的完成不仅能掌握平板划线分离微生物的方法，更能强化学生无菌操作的意识和良好的操作习惯。微生物的菌种选育-细菌的分离技能考核标准子情境：微生物的菌种选育-细菌的分离考核评价表学生姓名学号考核项目评价要点评价标准满分值学生自评小组互评企业评价教师评价专业能力考核（75'）基础知识学习态度端正，知识准备充分，知识点掌握牢固5方案制定设计方案可行，控制点全面，设备选用合理8小组讨论积极参与方案指定的研讨，提出可行性建议和修改方案10试剂配制合理计算药品用量、配置浓度，准确称量药品、配置试剂，相关仪器操作规范5平板划线分离培养皿底作分区标志、划线操

19、作、恒温培养22挑取单菌落挑取单菌落至斜面培养基15结果记录数据记录规范、完整，真实可靠5总结报告全面总结工作任务完成状况，合理解释出现的问题，客观评价自身的工作状况5方法能力考核（12.5'）资料收集查询书籍，并充分利用图书馆资源和网上资源，要求能够会使用专业数据库5问题解决从分区、划线培养、挑取单菌落等方面具体分析要求深入、全面，解决问题方法得当7社会能力考核（12.5'）团队合作善于沟通，能够积极与他人合作完成工作任务，集体责任感要求强，团结努力。6责任感爱护设备、教学设施、节约耗材、具有发酵行业的职业道德4安全意识水电气安全操作，注意环境保护3总分权重15%15%20%50%子情境：微生物的菌种选育-细菌的分离考核单项得分天津现代职业技术学院实训计划课程名称食品应用微生物基础实训学时4子情境微生