重组抗菌肽的特性：溶解性,抗菌性,影响抗菌肽活性的因素

1、重组抗菌肽的特性：溶解性，抗菌性，影响抗菌肽活性的因素摘要：菌丝霉素是第一个被发现的真菌防御素，具有强的抗革兰氏阳性菌活性。为了评估菌 丝霉素所潜在的治疗应用价值， 本文通过生产菌丝霉素， 并对其溶解性， 抗菌活性及影响抗 菌活性的因素进行研究。 我们通过融合蛋白表达和柱上酶切， 在大肠杆菌中得到高产量重组 的菌丝霉素。在 10%甘油的醋酸缓冲液中， 加入 0.5M 精氨酸能显著增加菌丝霉素的溶解性， 使菌丝霉素的溶解度从 89ug/ml上升到408ug/ml。菌丝霉素在 Tris-甘油-EDTA缓冲液的溶 解度为846ug/ml。菌丝霉素具有抗革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌活性，其最

2、 小抑菌浓度分别为 2ug/ml和0.5ug/ml。对革兰氏阴性菌和真菌没有抗菌活性或很低的抗菌 活性。菌丝霉素(128ug/ml)对兔子红细胞没有表现出溶血活性。减少二硫酥糖醇的浓度， 菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗菌活性会降低，表明二硫键对于抗菌肽最大活性是必须的。 菌丝霉素通过生理作用和二价阳离子作用起到杀菌作用。 抗菌活性会有微弱的减低在一定浓 度依赖的二价阳离子下，然而，Ca离子浓度超过25mM，抑菌活性完全丧失。这些结果表明，二硫键的存在和二价阳离子的缺乏在菌丝霉素抗菌活性上扮演这一个很重要的角色。 关键词 ：重组 菌丝霉素 溶解度 抗菌活性 二硫键 阳离子1 介绍菌丝霉素，是从腐生

3、真菌上首先分离到的类似防御素的多肽。包括一个a B主体结构，由一个a螺旋和两个反向 B股组成，通过3对二硫键来稳定结构(Cys4 ys30, Cys15 ys37 , Cys19ys39)。它对肺炎链球菌有强烈的机制作用，包括那些对传统抗生素有耐药性的菌 株，而且在生理离子浓度下也具有杀菌作用。 对由肺炎链球菌引起的胸膜炎和肺炎的实验小 鼠用菌丝霉素进行治疗，其效果与万古霉素和青霉素相当。菌丝霉素对A549 细胞，正常人类支气管上皮细胞， 肺成纤维细胞没有毒性， 不引起转录， 能刺激 A549 细胞产生 IL-8 因子， 所以其被认为是相对安全的。 这些结果表明， 真菌菌丝霉素作为临床上潜在的

4、抗生素替代品 将会做进一步的研究和关注。菌丝霉素在中性 PH 条件下溶解性很差，有报道表明，像葡萄糖，精氨酸，EDTA, 二甲基亚砜等小分子能有效的抑制其聚集， 从而便于蛋白质的正确折叠。 我们猜测这些小分子 可能是影响菌丝霉素的溶解度。防御素中二硫键被保留下来，一般认为对这一类型的多肽， 二硫键在维持结果稳定和生物功能上起着重要的作用。 然而， 在菌丝霉素中二硫键的作用并 没有完全弄明白。体外实验表明， 多数防御素的抗菌能力收到阳离子的影响， 特别在生理盐水存在的条件 下进行评估。 菌丝霉素在生理离子强度下表现出杀菌效果。 但是阳离子对菌丝霉素对金黄色 葡萄球菌的杀菌活性的确切的影响没有见到

5、相关报道。我们通过大肠杆菌表达系统得到了重组的菌丝霉素， 同时研究了小分子对抗菌肽溶解性 的影响。 我们对重组菌丝霉素的抗菌谱和溶血活性都做了描述， 并对二硫桥和离子对抗菌肽 的抗菌活性影响做了研究。2 材料与方法2.1 菌株和质粒E. coli DH5 用来繁殖 pET-32a(+) 和 pETplectasin 质粒 ,E. coli BL21(DE3) 作为表达载体，抗菌活性检测的目标菌株是E. coli CVCC 195(K88), Pseudomonas aeruginosa CVCC 2087,S. aureus ATCC 25923 and S. pneumoniae CVCC

6、2350 均购于中国兽医药品监察所，2.2 重组表达和菌丝霉素纯化成熟的菌丝霉素基因是根据大肠杆菌优势密码子通过反转录合成。由san gon生物科技公司(中国上海)合成的包含一个BamHI识别位点，一个蛋白酶因子Xa切割位点，成熟的菌丝霉素编码基因，终止密码子，Xhol位点的DNA序列。经过BamHI，Xhol消化后，将DNA序列连接到pET-32a(+)上，构建重组的PET菌丝霉素质粒载体，将 PET菌丝霉素质粒转化到 大肠杆菌DH5 a内，然后在添加100ug/ml的氨苄青霉素LB琼脂平板上培养，通过 DNA序列 来鉴定质粒的正确链接和转化。在37C下，将重组E.coli BL21 ( D

7、E3)培养在含有100ug/ml的TB培养基里，至 OD600为 1.00然后通过添加0.4mM IPTG诱导菌丝霉素基因表达。在 30C下，诱导表达的时间分别为 Oh, 1h, 2h, 4h, 6h , 16h。通过梯度离心(12,000 rpm, 5 min and 4 ?C)，收集上清液，通 过12%SDS-PAGE进行分析。1个湿重细胞经过 5ml结合缓冲液(50mM NaH2PO4 , 300mM NaCl,10mM 咪唑，pH8.0) 进行悬挂和细胞膜片段化处理(150W, 6X 5min of a 30%工作周期)。细胞碎片通过梯度 离心(12000rpm , 20min , 4

8、C)进行去除，上清液通过过His标签的Ni柱层析，用4柱体积的结合缓冲液进行平衡。用结合缓冲液洗便于后续基线吸收，融合蛋白的洗脱过程中4柱体积洗脱缓冲液的速率为 1ml/min，分别用四种浓度20, 50, 80, 200, 300, 500mM咪唑进行 洗脱。洗脱的产物用12%的SDS-PAGE进行检测。使用一种数量软件对蛋白质条带进行数量 分析。2.3 硫氧还 -菌丝霉素融合蛋白柱上切割和菌丝霉素的纯化重组细胞裂解后获得上层碎片被装载到已经平衡了的Ni - NTA树脂，用4柱体积的含有20mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。然后用Xa因子的缓冲液进行平衡，切割反应是在包含有20U Xa因子/ml

9、柱体积的切割缓冲液中进行，温度为21 C，时间分别为0, 6,12, 24, 48,96ho目的肽和His标签融合蛋白相继用 4柱体积的和包含有200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱即 可。通过0, 6, 12 , 24, 48, 96h切割分离得到相应的产物，并通过麦黄酮SDS-PAGE进行了检测。目的肽在中国科学院生物物理研究所蛋白质组学实验室通过飞行时间解吸质谱检测。2.4 小分子对菌丝霉素溶解度的影响将菌丝霉素装入1000Da截留分子量的透析管中置于去离子水中透析，然后冻干，储存在-20 C用于活性测定。有四种小分子物质(10% glycerol, 0.5M L-Arg, 20% DMSO a

10、nd 10mMDTT)被观察到其对菌丝霉素在两种溶液中溶解度有影响除盐的菌丝霉素溶解在 1mg/ml的0.01%HAc缓冲液中和 TGE缓冲液(50mM Tris, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.9),同时含有1-3的四种测试物质。然后，在室温下，摇床孵化24h。梯度离心收集上清液(15000Xg, 10min )，然后用不含3 -巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE。使用一种数量软件对 蛋白质条带进行数量分析( Version 4.6.2, Bio-Rad, USA )。2.5 抗菌活性和溶血活性的检测柱切割后获得目的肽片段，过superde

11、x柱进一步纯化，用0.015M NH4HCO3 ( pH 4.7)流速 为0.5ml/min进行洗脱。活性片段进行冻干。用肉汤培养基对最小抑菌浓度进行检测。被测 试微生物是处于对数生长期的培养在肉汤培养基中革兰氏阳性细菌，LB培养基中的革兰氏阴性细菌，和TPD中酵母菌。均稀释到1X 105CFU/ml，使用相同的培养基。MH肉汤培养基中增添5%去纤维蛋白的羊血用于肺炎链球菌的培养。每小分100ul细胞溶液(1-5X510 CFU/ml )和两倍的肽稀释液进行温育孵化，在35C下，大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌孵化16-20h，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌孵化24h，在28 C下，白色念珠菌孵化24h。

12、对微生物100%抑制的所需要抗菌肽浓度被认定为最小抑菌浓度。每个实验重复三次。菌丝霉素溶血活性是通过以前所发表的方法来测定。每份中分别0.625, 1.25, 2.5 , 5,10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280ug/ml 的菌丝霉素 10ul和 90ul 的2.5%家兔红细胞无菌 磷酸缓冲液。37C下孵化30min，样品于10000 x g离心3min，取上清液，置于540nm下测吸 光度。溶血程度归因于1% Triton X-100 ，磷酸缓冲液被用来做对照。2.6菌丝霉素的氧化还原性检测在10mM DTT溶液中，37C下温育14和20h，纯的菌丝霉素会被

13、还原。在 20% DMSO溶液 中，室温放置24h,菌丝霉素会被氧化。菌丝霉素还原和氧化均是通过不含有3 -巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE和抑制作用区域法进行检测。2.7 一价和二价阳离子对菌丝霉素抗-金黄色葡萄球菌活性的影响要确定阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗性的影响，将以下样品，16ug/ml的菌丝霉素，1 x 10结果 3.1硫氧还菌丝霉素融合蛋白的表达和纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白条带出现在23kDa附近，而理论相对分子质量为22566.4Da(Fig.2A )。经过4h诱导期后，融合蛋白最大产量达到了总蛋白的53.5% ( Fig.2A ), 58.5% 是以融合蛋白的形式存在

14、(Fig.2B )。通过过His标签Ni 2+-NTA柱从细菌细胞裂解液中分离 纯化融合蛋白部分，洗脱液用80mM咪唑，每升含硫氧还菌丝霉素融合蛋白培养液得到纯度为94.9%的产量达到95.1mg。CFU/ml金黄色葡萄球菌，4种梯度阳离子溶液 (0 - 300mM NaCI or KCl and 0 -50mM CaCl2 or MgCI2)加入含有1mM磷酸缓冲液(pH7.4 )的100ul体积，37C孵化3h,然 后，在37 C下至肉汤培养基培养 24h。细菌被杀死的比例通过 595nm下测定吸光度值来确定。ATT GAA GQC COC 8C TTT 町g T0C A AC CMK C

15、8 TTOG GJiT 貝 C ATG3XE Pl * GFCWGT tfPEP ATG C AG TGC CAT AJiC CAT TGC AAA JlGC JLTT AjU GOC TAT JU A GGC C TAT TOC貝qCHEH 匸 盖彗工 ICQTK GCJUUl G9C GGC TTT GTO TJC JU TOC TAT TA A U.Z8JKTA一_K_St一_r_3E一一K一C一I* mFijj. . Thenucleorjd s-eqiiecnure and玉ponding amina acidsccjuemce of recomibinnr plcctsin- Th

16、e amino cid sequeince is indicated try the on e-Letter code wri tten. below the second nucleotide of each codon. JEtom Hl andxhol restriction sites and thu factor Ka cleavage site arc indicated by arrows. The amino j匚id seq uence ot mature plectasm is tinderLini巳dL J he stop 匚odon is uuirked with an

17、 aster isik_Fig.1最佳密码子核苷酸序列和相应的重组菌丝霉素氨基酸序列。氨基酸序列用单个大写字母表示，其写在对应密码子的第二个核苷酸下面。XhoI和BamH的限制位点和Xa因子的切割位点用箭头标示。画线部分为成熟菌丝霉素的氨基酸序列。星号标识的是终止密码子。AH11S4 Id tB9 M M t S T M 1 F 94| T 1 9Fi* 乙 Exprcman c reccmbiiunt Tm-ptecliMppotcm in 轴 Al $0汕心E of 换顾 ppoltin$ 期wed in.H BU1 DE31 krna940弧245JJ35JMJ)2DUQ144. - _

18、Flee tarn-*Ml 23456789Fig. 4” Effect or smalt moleciile& on the solubility of plectasin. Equjl jnounts of desjltcd plectjsinil mg/m0weredisMlved in iwGsolvnts.O.OKHAc buffer ;Lancs 1 -5) andTCEbuffer (Lane& 6-9)T wit 11 smalI molecules (10 flyenol,0.5 M Argr 2OS DMSO and lOmM DTT) Mded as indicated.

19、 After incubati-on at room temperaajr for 24 li with gcmle s hiking, (he supernatants won? ha nested by cenrrifug;jrion (15,000 x gr !D mlD)andthe soluble plecusin content was ana I/zed by Tri 匚 ine-D5- PAtJ wLhour li-Tnercjptoettiano!Fig.4小分子物质对菌丝霉素溶解度的影响。等量的去盐菌丝霉素（1mg/ml ）被溶解在两种溶剂中，0.01%醋酸缓冲液（Lane

20、s 1-5）和TGE缓冲液（Lanes6-9），与小分（10%甘油，0.5M精氨酸，20%DMSO和10mMDTT） 加入作为显示。室温下轻微振荡孵化24h后，离心（15000g，10min ）取上清液，可溶性菌丝霉素经不含巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE分析。W1MIC of iKwbiiunt p eoasin an: dirfcotlcs jiusthcrerii and Lng. MKtntedStransMini 阳 I mhibiwy nmcefitration (MICRfucilbiVlnoonqclDAmphc:ifxin匸sn-re护胆EEIM】苹醐P期卿阖CVK2时12

21、黒 ml orM.MjknolIEm ml 泗脚mol-5.aif!ffiAKI25923D5 氐皿砒 iipcr.c.125 肚 IL f0.70 JtD-825 帽 ml(TO.tTpmospvuiTijiuf croc235OC559KI2 烟oHLG|UiDi2nilor筒卿：StI28品上上耳卜md-12卜呂ml orH 1134F 乂 I y : -!i- .a-d -!- r lr -：; - r - r.vr -hrr 1- -r :n- t t - - rh v - -ril - .-i - r :-p - Jhr Ifi|;： t prL nv -rrr. jh nhi -

22、;,! .r -n-ir .1 卢 M-.r 仃i亠 i 厲一HVii r II Frwf严仙fim ih吋wi-h |D nnkfl PIT;広JCE bnrfT|Hr d; I pnWI PTT; ifir pin he- was Ixxjed 弭 * -tQjiJ eC 3 7 C for 1 4djnd 2LJ h. nnr M. psrjEin Enokcubr mtwWL皿Fig.5氧化态和还原态的菌丝霉素。（A ）氧化态和还原态菌丝霉素对金黄色葡萄球菌活性的影响。（a）氨苄青霉素（100ug/ml，阳性对照）；（b）菌丝霉素（0.5mg/ml溶于TEG缓冲液中）；（c） TEG缓

23、冲液（阴 性对照）；（d ）用20%DMSO处理的菌丝霉素；（e）含有20%DMSO的TEG缓冲液；（f）用10mMDTT处理 过的菌丝霉素；（g）含有10mMDTT的TEG缓冲液；碟子（b） -（ g）每个装40ul。（ B）麦黄酮SDS PAGE分析氧化态和还原态的菌丝霉素。 Lane1 : 20%DMSO 处理的菌丝霉素；Lane2 :菌丝霉素 Lanes3-5:经10mMDTT在37C分别处理1h, 4h和20h； LaneM 蛋白 质分子质量标准AB-2= 10=2-O-KCIj-亠200Cr?niriOfi nNDUHX容Fig.6单价和二价阳离子对菌丝霉素抗金黄色葡萄球菌的活性影

24、响4 讨论来源于脊椎动物，植物，无脊椎动物的防御素都通过融合蛋白表达的方式在大肠杆菌中成功表达。对于融合蛋白表达的一个重要挑战是目的肽段的自由释放。Xa因子能准确的识别位点并切割，并且没有残留多余的氨基酸残基，广泛用天源抗菌肽的生产。未经沉淀的融合蛋白柱上切割方法，与传统的酶切消化并纯化的方法相比，可以避免因洗脱和透析造成的融合蛋白损失。该方法已经成功用于抗菌肽的纯化。在这次研究中，富含Cys的菌丝霉素多肽在大肠杆菌中得到成功表达并经柱上切割法而纯化。通过凝胶电泳分析表明，有21KD的小蛋白分子条带被观察到， 并通过Ni-NTA亲和色谱法纯化(Fig. 2B Lane S )。然而,21KD

25、条带在后面的麦黄酮 SDS-PAGE中无法检测到(Fig.A)。可溶性较小片段蛋白质可能是正常 折叠或非正常折叠亦或通过一种未知的折叠方式形成非特异的二硫键造成，最后的结论有待进一步研究。蛋白质溶解度低是药物开发过程中普遍的问题。小分子物质，如甘油，精氨酸等，被广泛用来防止蛋白质的错误折叠和聚集。在此次研究中，向10%甘油的醋酸缓冲液中加入精氨酸可以提高菌丝霉素在其中的溶解度。重组菌丝霉素抗菌谱被认为对细菌和真菌有一定抗性。 在体外实验中， 菌丝霉素对革兰 氏阳性细菌有强烈抗菌活性， 但是对革兰氏阴性菌和真菌表现出有限的抗性或者根本就不起 作用。这些结果与已有的报道相一致。 Mygind 等报

26、道，菌丝霉素不仅对鼠成纤维细胞和人 表皮角质化细胞没有毒性，而且对人红细胞没有溶血性。 同样的， 在此次实验中， 菌丝霉素 作用于家兔红细胞一样没有观察到溶血性。二硫键在稳定防御素结构上具有重要作用。二硫化物 Crp4 能保护多肽不被金属蛋白酶7 所降解。人防御素二硫桥具有稳定分子结构和维持抗菌活性的功能。一些研究结果表明， 防御素二硫键在抗菌活性中起到关键作用。对于Ten eci n1,二硫桥是具有活性的前提。Campopiano 等人得出结论表明，对 Defr1 二聚体亚型而言，分子间二硫键的形成能使其活 性和稳定性增强。然而， 一些研究也表明，防御素的抗菌活性与二硫键是相对独立的。吴等人

27、最近证明，人B防御素3的抗菌活性于二硫键无关，但是这一多肽的趋药特性依赖于二硫键的形式。Man dal等人报道表明，严格的B折叠结构或三个二硫键并没有表现出很严格迫切的需求对于B防御素的抗菌活性。 我们对还原态和氧化态的菌丝霉素的研究结果表明，菌丝霉素最大抗菌活性在其B片层三级结构中需要二硫键的结合。进一步的研究将关注这些差异。一些防御素，例如， 哺乳动物防御素和鸟类防御素，被证明抗菌活性对盐敏感。尽管单 价和二价阳离子对抑菌效果都有影响， 但是这些抑制效应依赖于总的离子强度。一个高的离子强度可能阻碍了带正电荷防御素与带负电荷的微生物细胞膜表面的相互作用。然而， sphe2就算在高离子强度下依

28、旧保持很高的活性。假设这种差异归因于抗菌肽净正电荷的差异。 Sphe-2净正电荷(+11)比其他防御素要高，可能可以减少高离子强度对抗菌活性的影响。 尽管菌丝霉素净正电荷( +3)低，但是它在相对较高离子强度的生理盐水中依然保持较高 的抗菌活性。在这个研究中，菌丝霉素抗菌活性受Ca2+和Mg2+影响，但是不受单价阳离子的影响。 我们的研究结果显示， 菌丝霉素活性可能包括一个特定的表面相互作用， 菌丝霉 素与目标微生物表面相互作用， 支持前人的研究， 菌丝霉素直接作用与细菌细胞壁前体脂质 II。详细探讨菌丝霉素，脂质II和二价阳离子之间的关系有待就一步的研究。我们的结论， 关于二硫键的作用和离子

29、对重组菌丝霉素抗菌活性的影响，为进一步研究菌丝霉素抗菌机理和潜在药物开发的发展奠定基础。致谢 本研究由国家自然科学基金支持 (Nos. 31001026,30972125,30771574,30810303084)，和北京市自然科学基金支持 (Nos.5093030, 5062031).参考文献1 Mygind PH, Fischer RL, Schnorr KM, Hansen MT, S鰊 ksen CP, Ludvigsen S, et al.Plectasinis a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprop

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