实验二 植物基因组DNA的提取

1、背景知识背景知识植物细胞中有哪些细胞器中含有DNA？与动物细胞的差别？背景知识背景知识DNA的存在形式的存在形式背景知识背景知识DNA的存在形式的存在形式背景知识背景知识DNA的存在形式的存在形式核苷酸双螺旋结构一级结构-核小体二级机构-螺线管三级结构-超螺旋管四级机构-染色体+组蛋白背景知识背景知识DNA的存在形式的存在形式nDNADNA为白色类似石棉样的为白色类似石棉样的纤维状物纤维状物，大都呈酸味。，大都呈酸味。 nDNADNA一般都溶于水，不溶于醇类、氯仿等有机溶一般都溶于水，不溶于醇类、氯仿等有机溶剂，在高盐溶液中的溶解度最大。剂，在高盐溶液中的溶解度最大。n在酸性溶液中易水解，中性

2、或弱碱性溶液中较稳在酸性溶液中易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。定。 DNADNA的理化性质的理化性质实验目的实验目的掌握CTAB法提取植物DNA的原理掌握CTAB法提取植物DNA的实验方法注意：此方法会把少量RNA提取出来，故后面通称核酸的提取。实验原理实验原理核酸-蛋白质复合体CTAB-核酸复合体+CTAB蛋白质变性剂蛋白质变性除去+高盐溶液溶解+沉淀剂沉淀核酸新鲜菠菜叶片新鲜菠菜叶片十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(CTAB) 、三羟甲基氨基、三羟甲基氨基甲烷甲烷(Tris(Tris) )、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)(EDTA-2Na)、氯

3、化钠、氯化钠、TrisTris饱和酚、异丙醇、饱和酚、异丙醇、-巯基乙醇、巯基乙醇、无水乙醇、氯仿、异戊醇、液氮、聚乙烯吡咯无水乙醇、氯仿、异戊醇、液氮、聚乙烯吡咯烷酮烷酮(PVP-40)(PVP-40)实验材料实验材料实实验验仪仪器器离心机：离心机：3 3台台/12/12管管水浴锅：水浴锅：6565研钵：研钵：1010个个移液枪（包括枪头）移液枪（包括枪头）实验试剂实验试剂2%CTAB抽提液：抽提液：250mlCTAB 4g无水乙醇 5ml 蒸馏水 100ml200ml烧杯5 mol/l NaCl 56ml1 mol/l Tris-HCl(PH8.0)20ml0.5mol/l EDTA 8m

4、l定容至250ml高压灭菌冷却后121 20min1% -巯基乙醇 2mlPVP-40 5g4 保存实验试剂实验试剂氯仿氯仿:异戊醇异戊醇=24:1 100ml氯仿 96ml异丙醇 4ml4 保存TE 缓冲液（缓冲液（保存保存 DNA） PH8.0 50ml 10mmol Tris-HCl(PH8.0) 0.5ml 0.5mol/l EDTA(PH8.0) 0.1ml定容至50ml 调PH8.0高压灭菌冷却后121 20min4 保存酚酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇=25:24:1 40ml取20ml前面配制的氯仿-异戊醇+20mlTris饱和酚2.破碎细胞，释放溶解核酸破碎细胞，释放溶解核酸快速

5、研磨成粉末轻摇匀取出冷却2分钟液氮液氮1ml 65CTAB抽提液抽提液1g菠菜叶片菠菜叶片65 水浴锅水浴锅40分钟分钟每每10分钟轻摇分钟轻摇10ml离心管预冷的预冷的研钵研钵实验步骤实验步骤1.准备工作准备工作蒸馏水洗净，晾干，剪小备用CTAB抽提液65 水浴锅水浴锅预热预热3.抽提去除蛋白质抽提去除蛋白质2.1ml酚-氯仿-异戊醇振荡 2分钟12000 r/min离心10分钟10ml离心管分层上清液核酸-CTAB变性蛋白有机溶剂10ml离心管2ml氯仿-异戊醇颠倒混匀12000 r/min离心10分钟分层变性蛋白有机溶剂上清液核酸-CTAB上清液核酸-CTAB实验步骤实验步骤4.沉淀核酸

6、沉淀核酸上清液核酸-CTAB-20异丙醇2.5ml10ml离心管室温沉淀10000 r/min离心10分钟5. 核酸的洗涤、脱盐核酸的洗涤、脱盐400ul无水乙醇去上清液10000 r/min离心10分钟6. 核酸的保存核酸的保存100ulTE缓冲液5.-20保存实验步骤实验步骤慢摇30秒室温15分钟在整个实验过程中应严格执行无菌操作；部分药品有毒，操作中应注意安全防护；磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低温状态 。刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔！ 抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂。将DNA加入异丙醇时用的枪头一定要剪过的。这点很重要。过尖的枪头会把DNA链弄断。 注意事项注意事项思考题思考题本实验中用到的各种试剂的作用是什么？本实验中进行了几次离心操作，每次的目的？实验安排实验安排按照学号分组进行实验，每6人一组，一组做3管，用一个研钵。每3组共用1台离心机同时进行离