肠病毒感染及抗ADPATP载体抗体在病毒性心脏病发病中的意义

1、    肠病毒感染及抗ADP/ATP载体抗体 在病毒性心脏病发病中的意义*        摘要目的：探讨肠病毒感染与抗二磷酸腺苷/三磷酸腺苷(ADP/ATP)载体抗体在病毒性心脏病发病中的意义。方法：应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫转印法对临床诊断为病毒性心肌炎(VMC)和扩张型心肌病(DCM)患者进行肠病毒核糖核酸(RNA)及抗ADP/ATP载体抗体的检测。结果：RT-PCR方法检测肠病毒RNA，VMC组(n=74)42例(56.8%)阳性，DCM组

2、(n=26)11例(42.3%)阳性。与健康组(n=30)比较具有显著性差异(分别P0.01，P0.05)；肠病毒感染与DCM患者心脏功能降低有明显相关性。免疫转印法检测VMC(n=34)和DCM(n=26)患者血清抗ADP/ATP载体抗体，VMC组23例(67.6%)阳性，DCM组12例(46.2%)阳性，而健康组均为阴性；抗ADP/ATP载体抗体和肠病毒RNA的检出相关(r=0.442)。结论：肠病毒RNA和抗ADP/ATP载体抗体在病毒性心脏病患者中检出具有相关性，对临床上出现前驱感染和心脏症状的患者，及时进行肠病毒RNA、CVB-IgM、抗ADP/ATP载体抗体的检测，有助于VMC和D

3、CM的早期诊断。关键词病毒性心肌炎扩张型心肌病肠病毒自身抗体聚合酶链反应 Significance of enterovirus infection and antibody againstADP/ATPcarrier in the etiology of viral heart diseaseLiu YingLiao YuhuaDong Jihuaet al(Institute ofcardiology, Tongjimedical University, Wuhan 430022)AbstractObjective:To evaluate the roles of enterovirus

4、(EV) infection and autoantibody against ADP/ATPcarrier in the pathogenesis of viral heart disease (VHD).method:The reverse transcription-polymerasechain reaction (RT-PCR) amplification assay and western blot assay were developed to detect EVs ribonucleic acid (RNA) and autoantibody against ADP/ATPca

5、rrier in sera from patients suspected of viralmyocarditis(VMC) and DCM. Result:42 of 74(56.8%) patients with VMC and 11 of 26(42.3%) patients with ditaledcardiomyo pathy(DCM) suffered from EVs-RNA infection,both weremuch higher than the health group (n=30). The EVs-RNA infection hadmarkedcorrelation

6、 to the heart function in patients with VHD. The autoantibody against ADP/ATPcarriercould be found in 23 of 34(67.6%) patients with VMC and 12 of 26(46.2%) patients with DCM, while it was negative in the health group. The autoantibody against ADP/ATPcarrier and the EVs-RNA infection hadmarkedcorrela

7、tion in patients with VHD (r=0.442).conclusion:The EVs-RNA and autoantibody against ADP/ATPcarriercould be detected in patients with VHD. To the patients who had precursory infection andcardiac symptoms, the detection of EVs-RNA,CVB-IgM, and autoantibody against ADP/ATPcarriercouldcontribute to th e

8、arly stage diagnosis of the viral heart diseases.KeywordsViralmyocarditisDilatedcardiomyopathyEnterovirusAutoantibodyReverse transcription polymerasechain reaction大量临床资料及实验研究提示病毒性心肌炎(VMC)可以转化为扩张型心肌病(DCM)，并将与病毒有关的心肌疾病统称为病毒性心脏病(VHD)1。关于VMC和DCM的病因，目前多认为与病毒感染和自身免疫反应有关。为探讨VHD的病因及发病机理，本研究采用逆转录聚合酶链式反应(RT-P

9、CR)及免疫转印法，对临床诊断为VMC和DCM患者血清进行肠病毒核糖核酸(RNA)和抗二磷酸腺苷/三磷酸腺苷(ADP/ATP)载体抗体的检测，探讨肠病毒感染与抗ADP/ATP载体抗体在VHD发病中的意义。1材料与方法1.1主要材料逆转录酶(AMV)购自美国Promega公司，Taq酶购自加拿大Sangon公司，引物P1、P2参照文献2合成，产物为314 bp。P1：5CGGTACCTTTGTGCGCCTGT 36383P2：5CAGGCCGCCAACGCAGCC 33593771.2研究对象VHD组：100例，均符合1995年全国心肌炎、心肌病专题研讨会拟订的成人急性VMC和特发性DCM诊断参

10、考标准3，其中VMC组74例，男41例，女33例，年龄753岁，平均(23.1±19.3)岁；DCM组26例，男15例，女11例，年龄1564岁，平均(45.3±24.6)岁。超声心动检测心功能。健康组：健康献血员30例，男15例，女15例，平均年龄(22.8±3.2)岁。1.3肠病毒RNA RT-PCR肠病毒RNA提取：取病人血清100l,依次加入GITC变性液200l，氯仿/异戊醇(491)50l，2molNaAc 25l(pH4.0)水饱和酚200l，剧烈振荡15s后置-20冷却10min，12000 r/min离心5min，取上清200l加入等体积异丙醇，

11、-20静置1h，12000r/min离心10min，弃上清，乙醇洗涤沉淀，开盖自然挥发或烘干备用。肠病毒RNA RT-PCR：按以下比例加入RT-PCR各成分：双蒸水14.35l，10×Buffer 2l,15mmolmgCl2 2l,10mmoldNTP各0.1l共0.4l,引物P1(50 pmol)0.4l，P2(50 pmol)0.4l，Taq酶0.2l，逆转录酶AMV 0.25l，共计20l；42恒温水浴逆转录30min，即可进行扩增。程序如下：94变性5min；94变性30 s，60复性30 s，72延伸90 s，共30个循环，72延伸5min。电泳：取扩增产物6l加溴酚蓝

12、显示剂点样于2%琼脂糖凝胶(含EB 0.5g/ml)上，100V电泳30min，于紫外灯下观察结果。1.4柯萨奇病毒B(CVB)-IgM检测ELISA间接法：将CVB 16病毒抗原与包被液(pH 9.6，0.05mol碳酸盐缓冲液)110稀释，于微量反应板中每孔加150l，置4过夜。倾去包被液，用洗涤液(pH 7.4，0.01mol PBS-Tween 20)加满各孔，置3min，洗涤3次。加120稀释待测血清150l，置42孵育45min；洗涤后加12000稀释HRP标记兔抗人IgM(同济医科大学协和医院病毒室产品)150l，42孵育30min；洗涤后加底物液(OPD-H2O2柠檬酸-磷酸盐

13、缓冲液)150l，37放置15min，0.01mol H2SO4终止反应。酶标仪492nm处读数并记录OD值，以大于健康组OD值的均数与2.1倍标准差之和为阳性。1.5抗ADP/ATP载体抗体检测参照廖玉华等4的免疫转印法，待测血清110稀释，HRP-羊抗人IgG 150稀释，在转印膜29 763 u处出现棕色条带者为阳性。1.6统计学方法计数资料以均数±标准差表示，采用t检验、2检验、相关分析。2结果2.1VHD患者肠病毒RNA和CVB-IgM检测的比较对临床诊断为VMC和DCM的患者进行肠病毒RNA和CVB-IgM抗体检测，结果显示VMC组和DCM组均明显高于健康组，但VMC组C

14、VB-IgM抗体阳性率比DCM组更高。见表1。表1VHD患者血清肠病毒感染与病毒抗体出现情况组别总例数EV-RNA阳性CVB-IgM阳性例数%例数%VMC组7442*56.836*48.6DCM组2611*42.35*19.2健康组3026.713.3与健康组比较*P0.05，*P0.01；与DCM组比较P0.05，P0.01 2.2DCM患者肠病毒感染与心功能的关系26例DCM患者中，11例肠病毒RNA阳性和15例阴性患者的左室舒张期末内径分别为(6.89±1.76)cm与(6.40±2.30)cm(P0.05)，11例肠病毒RNA阳性患者中有10例射血分数45%(占90

15、.9%)，而15例阴性患者中仅有8例射血分数45%(占53.3%)，两组间具有显著性差异(P0.05)。提示病毒持续感染与VHD患者心功能改变具有相关性。2.3VHD患者肠病毒感染与抗ADP/ATP载体抗体的关系免疫转印法检测60例VHD患者血清抗ADP/ATP载体抗体，VMC组34例中外周血肠病毒RNA 23例阳性(67.6%)，DCM组26例中12例阳性(46.2%)，健康组30例均为阴性。表明，肠病毒感染与抗ADP/ATP载体抗体的产生具有相关性(r=0.442，P0.001)。3讨论我们采用肠病毒5端保守区的一对通用引物，对100例临床诊断为VHD的患者及30例健康人进行RT-PCR检

16、测，发现56.8%的VMC患者和42.3%的DCM患者外周血中可检出肠病毒RNA，而健康人检出率仅6.7%，说明在VMC和DCM的发病中，肠病毒RNA感染是一个重要原因。CVB-IgM抗体检测是VMC早期诊断的重要指标之一，本研究对VMC和DCM患者均进行CVB-IgM抗体的检测，其患者CVB-IgM抗体阳性率均明显高于健康人群，同时发现VMC组的CVB-gM抗体阳性率明显高于DCM患者，这可能是由于VMC患者均为病毒感染急性期，而DCM患者大多病程较长，IgM抗体滴度已显著下降或消失。ADP/ATP载体位于心肌线粒体内膜，占线粒体蛋白含量的12%，其主要功能是在线粒体与胞浆之间转运ATP，参

17、与心肌细胞的能量代谢。抗ADP/ATP载体抗体在DCM和VMC患者血清中检出频率较高，在其他心脏病如风湿性心脏病、冠心病及正常人血清中检出频率很低，对于DCM的诊断具有特异性4。近年来研究发现抗ADP/ATP载体抗体通过对心肌细胞膜钙通道的作用，引起心肌细胞膜钙电流增加和细胞浆游离钙浓度增加，导致心肌细胞毒性损害59。本组对60例VHD患者进行抗ADP/ATP载体抗体检测，VMC患者阳性率为67.6%，DCM患者为46.2%，30例健康人均为阴性，说明抗ADP/ATP载体抗体与VMC或DCM的发病有一定关系。Schwimmbeck等10发现CVB3第12181228位氨基酸与人线粒体内膜ADP

18、/ATP载体抗体蛋白第2738位氨基酸高度同源，实验表明，抗ADP/ATP载体第2738位肽的抗体不仅与ADP/ATP载体第2738位肽反应，也与CVB3第12181228位肽反应，抗CVB3第12181228位肽抗体与CVB3 12181228和ADP/ATP载体也均发生反应。本研究还发现60例VHD患者抗ADP/ATP载体抗体阳性的35例患者中，30例可检出肠病毒RNA，符合率为85.7%；该抗体阴性25例患者中，仅有11例可检出肠病毒RNA，抗ADP/ATP载体抗体与肠病毒RNA的检测结果具有相关性。病毒基因和自身抗体检出的一致性，可能是由于人体内线粒体ADP/ATP载体蛋白与CVB3外

19、壳蛋白有一段高度同源的序列10。根据分子模仿理论，肠病毒感染，尤其是CVB组病毒感染人体后激活机体免疫系统，产生抗病毒抗体，并产生抗心肌线粒体ADP/ATP载体自身抗体。目前认为，肠病毒持续感染和自身免疫系统激活引起的自身免疫损伤是DCM的主要发病机制1。本研究对26例DCM患者进行肠病毒检测，肠病毒感染阳性患者中90.9%的患者左心室射血分数45%，而阴性患者中仅有53.3%的患者左心室射血分数45%，说明肠病毒持续感染与心脏收缩功能降低可能有关。肠病毒感染不仅可以引起直接的心肌损伤，还可以激活机体免疫系统，诱导机体产生抗心肌自身抗体，引起免疫性心肌损伤。在一些病程较长的DCM患者中，病毒检

20、测为阴性，而心功能继续恶化，可能与病毒感染继发的持续的免疫损伤有关。总之，肠病毒感染与抗ADP/ATP载体抗体在VHD患者血清中发现，对于揭示该病的发病机制具有重要意义，肠病毒RNA和抗ADP/ATP载体抗体检测对VHD的诊断具有重要临床价值。*国家“九五”科技攻关基金部分资助项目(96-906-02-13)作者单位：同济医科大学心血管病研究所(武汉，430022)研究生，现在北京市公安医院内科(北京，100006)参考文献1Kandolf R, Klingel K, Zell R, et al.molecularmechanisims in pathogenesis of enterovir

21、al heart disease:acute and persistent infections.clin Immunol Immunopathol,1993,68:1531582Linderberg AM, Stalthandske POK. Genome ofcoxsackievirus B3. Virology,1987,156:50633全国心肌炎、心肌病专题研讨会组委会.全国心肌炎、心肌病专题研讨会纪要.临床心血管病杂志，1995，11：3243254廖玉华，涂源淑，李淑莉，等.扩张型心肌病抗心肌线粒体ADP/ATP载体自身抗体的研究.中华心血管病杂志，1994，22：43455Liao YH. Functional analysis of autoantibodiesagainst ADP/ATPcarrier from dilatedcardiom-yopathy. Int Jcardiol,1996,54:1651696Schultheiss HP, Kuhl U, Janda I, et al. Antibody-mediated enhancement ofcalcium permibi-lity incardiacmyocytes. J Expmed,1988,168:21052