噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中的应用和优化

1、噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中的应用和优化         08-07-21 10:03:00     编辑：studa20         作者：徐泱 孙惠川 汤钊猷 樊嘉 周俭 钦伦秀 刘银坤【摘要】  目的 克服体内噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中应用的技术障碍。方法 采用噬菌体体内分布及代谢实验研究噬菌体在裸鼠体内的分布及代谢规律，比较噬菌体饱和灌注、聚肌苷(P

2、oly )及不同的活体灌洗技术对组织中噬菌体分布的影响。结果 肝脏等网状内皮系统器官可非特异性结合噬菌体。这种结合可被空白噬菌体饱和灌注所抑制(P<0.01)，而Poly 无显著影响(P>0.05)。左、右心室加门静脉灌洗较单纯左心室灌洗可显著减少组织血管中血液及未结合噬菌体的残留(P<0.01)。结论 经过改进优化的体内噬菌体展示技术可为肝癌肿瘤血管异质性研究提供稳定、高效的技术平台。 【关键词】  噬菌体展示； 肝肿瘤； 肿瘤血管； 异质性    【Abstract】  Objective  To circumv

3、ent the obstacle of in vivo phage display for study of vascular heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Methods  The distribution and metabolic law of phage in the athymic mouse was detected by using in vivo phage display and metabolic experiment to compare the effects of f1tet phage presatu

4、ration, Poly preinjection and modified perfusion on distribution of phage in the tissues. Results  The nonspecific phage trapped by liver (belonged to the reticuloendothelial system, RES) was decreased significantly by presaturation of filamentous insertless phage (P<0.01), but not affected

5、by the preinjection of Poly (P>0.05).Left and right ventricle plus portal vein lavage could more significantly decrease blood volume in the vessels and residuals of untrapped phage (P<0.01). Conclusion  The modified in vivo phage display offers an ideal method for study of vascular hetero

6、geneity in hepatocellular carcinoma.    【Key words】  Phage display;  Liver tumors;  Tumor vasculature;  Heterogeneity    肿瘤血管“异质性”是血管生成研究中的热点。噬菌体文库体内展示技术在1996年一出现，就立刻成为血管异质性研究的理想工具1-2。现在，应用噬菌体展示体内筛选技术已得到针对不同组织或肿瘤血管的特异性靶向分子3-4。但肝、脾等属于网状内皮系统的器官能够非特异性地吞

7、噬或吸附噬菌体，而一直未有相关报道5。本研究的主要目的是探讨克服肝脏对噬菌体文库非特异性吞噬或吸附的方法，建立稳定、高效的肝癌噬菌体文库体内展示技术平台，为肝癌肿瘤血管异质性研究提供强有力的工具。    1  材料与方法    1.1  材料7噬菌体随机7肽库及M13mp19空白对照噬菌体购自美国NEB公司(Cat.No. E8100S；N4019S)，f1tet空白噬菌体由中科院上海生物化学研究所惠赠。    1.2  方法    1.3

8、60; 统计学分析    数据用SPSS 11.0处理，结果以±s表示。单因素方差分析比较各组内参数差异，配对资料采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。    2  结果    2.1  噬菌体体内分布及代谢实验    肝脏可大量非特异性地结合血液循环中的噬菌体，其结合的噬菌体较其他器官(组织)高约101 000余倍，肿瘤亦有非特异性结合噬菌体的能力(图1)。噬菌体主要经肝肾代谢，噬菌体在血液中的代谢周期约为72 h(图2)。在注

9、射噬菌体后4 min，从肝脏与肿瘤中复苏的文库噬菌体与M13噬菌体的数量比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在其他组织中差异有统计学意义(P<0.01，图3)。    2.2  不同活体灌洗技术的比较    改良灌洗组，肝、肿瘤、肾、肺组织中的M13空白噬菌体数较传统灌洗组显著降低(肝、肿瘤、肾脏：P<0.05；肺：P<0.01)，平均下降到10%左右(图4)。活体灌洗并不影响噬菌体增殖活性。    2.3  Poly 抑制实验  

10、60; 注射M13噬菌体及文库噬菌体的Poly 各剂量组与PBS对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。    2.4  噬菌体饱和灌注实验    肝脏及肿瘤中结合的噬菌体数量随f1tet空白噬菌体注入量的增大而逐渐增加，但当注入噬菌体1012 pfu后，肝脏及肿瘤中结合的噬菌体数量就稳定保持在1011 pfu及106 pfu而不再增加；M13与f1tet噬菌体变化基本一致(图5、6)。经过量的f1tet空白噬菌体(1012 pfu)预饱和后，肝脏、肿瘤、肾脏、肺及脑组织与M13空白噬菌体的结合均显著被抑制(肝

11、、肿瘤、肾、肺：P<0.01；脑：P<0.05)；肝脏、肿瘤、肾脏及肺组织结合文库噬菌体较PBS对照组亦显著减少(P<0.01)，肝脏所结合噬菌体与其他组织的差异明显减少(图7)。    3  讨论    越来越多的证据表明，肿瘤血管生成在肿瘤生长、转移和复发的各个环节均有重要作用7-8。肿瘤血管具有不同于正常血管的“异质性”也已逐渐取得共识9。肿瘤血管研究方面的进展，都离不开研究技术手段的进步。其中噬菌体文库体内展示技术在“血管异质性”研究方面发挥了重要的作用。噬菌体展示技术由美国Smith10在1985年首先报道，其原理是将序列不同而长度相同的合成寡核苷酸插入到噬菌体衣壳蛋白基因序列之中，外源多肽就可以表达在噬菌体衣壳蛋白的表面，由此就可能生成巨大的、可以展示数千万个肽的重组噬菌体文库。1996年，Pasqualini又在噬菌体文库体外展示技术的基础上发展出噬菌体文库体内展示技术1，即把噬菌体文库注入动物体内，