压力超负荷时心肌闰盘的改变

1、    压力超负荷时心肌闰盘的改变        【摘要】目的研究压力超负荷时心肌闰盘的变化。方法采用大鼠腹主动脉缩窄模型，在透射电镜下观察心肌闰盘的超微结构变化；免疫组化观察钙粘素(pan-cadherin),连接蛋白43（connexin 43，Cx43),桥粒蛋白（desmoplakin）的表达。结果术后10周手术组心肌闰盘的粘着膜、桥粒、间隙连接结构模糊，连接间隙增宽；Pan-cadherin,Cx43,desmoplakin 在心肌细胞表面呈无序分布。结论压力超负荷

2、时心肌闰盘的主要结构及其成分均发生了改变，这可能是左室重塑的病理基础之一。【关键词】闰盘；压力超负荷Change of intercalated discs of myocardium induced by pressure overloadZHANG Ping,HE Guoxiang,WANG Guochao,et al.(Department of Cardiology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,PLA,Chongqing 400038,China)【Abstract】ObjectiveTo investiga

3、te the change of intercalated discs induced by pressure overload.MethodsThe model of rat abdominal aortic constriction was adopted.Ultrastructures of the intercalated discs were observed by electron microscopy.Expression of pan-cadherin,connexin 43 (Cx43) and desmoplakin in the cardiomyocytes were s

4、tudied by immunohistochemical technique.ResultsAt the 10th week after constriction,the structure of cadherin,desmosome and gap junction in intercalated discs were destroyed,gap of intercellular space widened.Pan-cadherin,Cx43 and desmoplakin distributed disorderly on the surface of cardiomyocytes.Co

5、nclusionThe results indicate that the structure of intercalated discs and its components are changed during left ventricular pressure overload,and it might be one of the pathological basis of left ventricular remodeling.【Key words】Intercalated disc;Pressure overload近年来，对左室重塑的研究主要集中于心肌细胞和心肌间质的改变，而对心肌

6、细胞间连接闰盘的研究甚少。已知闰盘是心肌电、机械和代谢耦联的结构基础，因此，深入研究心肌肥大时闰盘结构和组成的变化有可能对心肌重塑的认识带来新的启迪。本研究采用大鼠腹主动脉缩窄模型，主要对压力超负荷时心肌闰盘中的粘着膜，桥粒和间隙连接的改变进行了观察，旨在研究肥大心肌闰盘的改变。材料与方法1.主要材料：兔抗人钙粘素（pan-cadherin）多克隆抗体（美国Sigma 公司），兔抗人连接蛋白43（connexin 43,Cx43）多克隆抗体（美国New York 大学），鼠抗人桥粒蛋白（desmoplakin） 单克隆抗体（第三军医大学西南医院皮肤科），免疫组化SP试剂盒（北京中山生物公司）。

7、2 动物模型与分组：雄性Wistar大鼠（由第三军医大学实验动物中心提供）16只，体重150180 g,随机分为假手术对照组（n=8）和手术组(n=8)。戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉下分离出腹主动脉，用丝线将其与去尖的7号针头一同结扎，然后抽出针头，使腹主动脉缩窄成直径0.7mm。对照组除不用丝线结扎外，其余步骤同手术组。术后10周处死动物。3 指标检测方法：(1)左室湿重、左室重量指数和左室壁厚度的测定：直接开胸取出心脏，去除心房、右室游离壁、大血管和心包组织，称左室湿重（含室间隔），计算左室重量指数=左室湿重/体重（mg/g）。在左室中部沿横轴切取0.5 cm厚的心肌组织置于10%福

8、尔马林中固定，石蜡切片，HE染色，并在光学显微镜下测左室壁厚度（以室间隔和左室前、后壁均值表示）。(2)闰盘超微结构观察：取左室游离壁最厚处中层心肌组织1 mm3为标本作透射电镜观察，每例标本包埋8块以上，选心肌细胞纵切面拍摄照片。(3)闰盘的免疫组化染色： 取材于左室游离壁，用Zambonis液固定标本，冰冻切片和石蜡切片，分别以Pan-cadherin,desmoplakin,Cx43为一抗进行免疫组化染色（SP法）。4 统计学处理： 数据用±s表示，采用t检验。P<0.05差异有显著性，P<0.01差异非常显著性。结果1 左室湿重、左室重量指数和左室壁厚度的变化（表

9、1）： 术后10周，手术组左室湿重、左室重量指数和左室壁厚度与对照组比较，差异有显著性（P<0.05，P<0.01）。表1术后大鼠左室湿重、左室重量指数和左室壁厚度的变化（n=8,±s）组别左室湿重(mg)左室重量指数(mg/g)左室壁厚度(mm)对照组777.88±124.382.27±0.182.04±0.12手术组1 122.38±229.20*3.15±0.59*2.94±0.29*注：与对照组比较，* P<0.05，* P<0.01 2 闰盘超微结构的改变： 对照组心肌细胞的闰盘结构清楚，形

10、态正常，其中粘着膜、桥粒和间隙连接清晰，呈阶梯状排列，横向部位主要是粘着膜和桥粒以及小的间隙连接，大的间隙连接主要位于纵向部位。手术组闰盘广泛扩张，粘着膜、桥粒和间隙连接结构模糊，连接间隙明显增宽（1）。3 Pan-cadherin,Cx43,desmoplakin表达的变化： 对照组心肌细胞Pan-cadherin,Cx43,desmoplakin呈点状或带状主要分布于闰盘处，成阶梯状排列（2-a,3-a,4-a）。手术组心肌闰盘的Pan-cadherin,Cx43,desmoplakin表达显著减少，细胞表面可见大量无序分布的以上三种蛋白的阳性反应信号（2-b,3-b,4-b）。讨论闰盘是

11、由非特化肌膜、粘着膜、桥粒和间隙连接共同组成的特殊结构1。其中，cadherin组成的粘着膜是细胞骨架-肌动蛋白(-actin)的锚着点,将相邻的心肌细胞粘连起来;桥粒的结构蛋白desmoplakin则通过plakoglobin将中间丝附着于其胞质侧的致密斑上,牢固细胞连接,负责力的传递。粘着膜和桥粒主要与心肌机械耦联有关。Cx43组成的间隙连接通道不仅可以直接传递离子、小分子代谢物质和次级信使，且作为一种低电阻通道，是心肌电耦联的物质基础。本实验结果显示，对照组相邻心肌细胞端-端相接处的粘着膜、桥粒和间隙连接形状结构正常，这三种细胞连接的结构蛋白Pan-cadherin,desmoplaki

12、n,Cx43免疫组化反应阳性表达大多分布于闰盘处，呈阶梯状排列，对照组Cx43分布密度在心肌细胞纵向较横向高，推测这是正常情况下动作电位在纵向传导速度较横向快的缘故2。迄今为止，对病理情况下粘着膜、桥粒和间隙连接变化和意义的研究不多。本研究在大鼠腹主动脉缩窄模型上观察到手术组粘着膜、桥粒、间隙连接结构模糊，排列紊乱，连接间隙明显增宽，Pan-cadherin,desmoplakin,Cx43在闰盘的分布减少，细胞侧-侧面和表面的免疫组化反应阳性表达增多，并呈无序排列，与胚胎时期的特征相似3。本实验中肥大心肌细胞Pan-cadherin,desmoplakin和Cx43的形态和分布基本相似，由于

13、光镜下难以区分粘着膜、桥粒和间隙连接，限制了对这三种细胞连接变化的进一步研究。压力超负荷致粘着膜、桥粒、间隙连接变化的机制尚未清楚，由于cadherin,desmoplakin是Ca2+依赖性的细胞粘附因子，压力超负荷时粘着膜和桥粒的变化可能与肥大心肌细胞内的Ca2+失稳态有关；间隙连接变化则可能与Cx43的内陷(internalization)、降解和过度磷酸化有关4。粘着膜和桥粒在细胞侧-侧面的增多，一方面可抵抗心肌收缩产生的应切力，防止平行排列的心肌细胞之间的滑行，是一种代偿保护机制；另一方面使心肌僵硬度增加，阻碍肌纤维运动，心脏舒张失协调，可能是左室重塑早期心脏舒张功能受损的一个重要原

14、因。Cx43在心肌细胞由纵轴向横轴的重新分布，使细胞间纵向阻抗增加，冲动传导速度减慢；Cx43在细胞表面的无序分布则可能造成非均匀性电脱耦联，致单向阻滞区形成。这两种变化均有利于折返性心律失常的发生。这很可能是肥大心肌发生室性心律失常的一个重要原因。Peter等5发现心肌梗死边缘带Cx43紊乱分布处正是产生折返环的位置。因此，心肌压力超负荷时粘着膜、桥粒和间隙连接的变化是心肌电、机械耦联障碍的病理基础之一。1手术组心肌闰盘粘着膜、桥粒和间隙连接结构模糊，间隙增宽，排列紊乱(TEM×15K)2对照组(a)和手术组(b)心肌Pan-cadherin的分布比较3对照组(3a)和手术组(3b

15、)心肌Cx43的分布比较4对照组(4a)和手术组(4b)心肌desmoplakin的分布比较(张萍,硕士生何国祥,硕士生作者单位：张萍(第三军医大学西南医院心内科重庆市，400038)何国祥(第三军医大学西南医院心内科重庆市，400038)王国超(第三军医大学西南医院心内科重庆市，400038)迟路湘(第三军医大学西南医院心内科重庆市，400038)参考文献1，Forbes MS,Sperelalkis N.Intercalated discs of mammalian heart:a review of structure and function.Tissue Cell,1985,17:6

16、05-648.2，Peters NS.Gap junctions and clinical cardiology:from molecular biology to molecular medicine.Eur Heart J,1997,18:1697-1702.3，Angst BD,Khan LUR,Severs NJ,et al.Dissociated spatial pattering of gap junctions and adhesion junctions during postnatal differentiation of ventricular myocardium.Cir Res,1997,80:88-94.4，Saez JC,Nairn AC,Czemik AJ,et al.Phosphorylation of connexin 43 and the regulation of neonatal rat cardiac myocyte gap junctions.J Mol Cell Cardio,1997,29:2131-2146.5，Pete