一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法

1、www.CRTER.org张作慧，等. 一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法张作慧1，陈 晨2，陈 浩1，崔桂云1，花 放1( 1徐州医科大学附属医院神经内科，徐州医科大学神经病学教研室，江苏省徐州市 221002；2徐州医科大学附属医院神经外科，徐州医科大学神经外科学教研室，江苏省徐州市 221002)引用本文：张作慧，陈晨，陈浩，崔桂云，花放. 一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法J.中国组织工程研究，2016，20(51):7666-7671.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51

2、.010 ORCID: 0000-0002-8486-4767(张作慧)文章快速阅读：原代脑微血管内皮细胞的分离与培养张作慧，女，1980年生，汉族，2014年南京大学毕业，博士，副主任医师，曾于美国NIA阿尔茨海默病研究中心(Sanders- Brown Center on Aging)接受博士后训练，主要从事阿尔茨海默病的临床及基础研究。通讯作者：花放，教授，主任医师，徐州医科大学附属医院神经内科，江苏省徐州市 221002中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)51-07666-06稿件接受：2016-11-04经酶消化及梯度离心法获得微血管段使用Cla

3、udin-5免疫荧光染色鉴定紧密连接蛋白的表达利用CD31和GFAP免疫荧光染色鉴定内皮细胞纯度结果表明：免疫荧光显示内皮细胞纯度达99%以上，并广泛表达紧密连接蛋白。 文题释义：人脑微血管内皮细胞：是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。紧密连接：由分支状封闭索网络组成，每条封闭索独立于其他封闭索作用。因而，紧密连接防止离子通过的能力随封闭索的数目指数式增长。每条封闭索由一列嵌入两个原生质膜的跨膜蛋白构成，蛋白的胞外结构域使其彼此间一个个直接相联。尽管还有其他蛋白存在，两种主要类型的蛋白是密封蛋白和闭合蛋白，它

4、们与位于细胞膜内侧的不同的把封闭索锚定到肌动蛋白细胞骨架的外周膜蛋白相联。因此，紧密连接连起了相邻细胞的细胞骨架。摘要背景：脑微血管内皮细胞是神经科学研究领域的重要工具细胞，如何获得高纯度的脑微血管内皮细胞一直是体外研究的关键和难点。目的：探索一种简便易操作，高纯度的原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法：使用6-8周龄C57BL/6小鼠，经酶消化及梯度离心法获得微血管段，使用药物进一步纯化内皮细胞，利用CD31和GFAP免疫荧光染色鉴定内皮细胞纯度。使用Claudin-5免疫荧光染色鉴定紧密连接蛋白的表达情况。结果与结论：细胞呈旋涡状或铺路石样排列、生长；免疫荧光显示内皮细胞纯度达99%以

5、上，并广泛表达紧密连接蛋白；结果表明，实验建立了一种简便、易操作的，可以获得大量高纯度的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法。关键词：组织构建；血管内皮细胞；脑微血管内皮细胞；小鼠；原代培养；形态学；细胞免疫荧光；CD31；Claudin-5；国家自然科学基金主题词：内皮细胞；细胞培养；荧光免疫测定；组织工程基金资助：国家自然科学基金青年基金(81501095)；江苏省六大人才高峰资助项目(2014-WSN-034)7667 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Isolation and culture of primary microvascular

6、endothelial cells from mouse brainsZhang Zuo-hui1, Chen Chen2, Chen Hao1, Cui Gui-yun1, Hua Fang1 (1Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurology of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China; 2Department of Neurosurgery

7、, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurosurgery of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China)AbstractBACKGROUND: Brain microvascular endothelial cells (BMECs) are important tools in the field of neuroscience research; therefore, how to obtai

8、n highly purified BMECs is a key and difficulty in vitro. OBJECTIVE: To develop a simple method of isolating and culturing highly purified BMECs. METHODS: C57BL/6 mice aged 6-8 weeks old were selected, and microvessels were obtained using enzyme digestion and gradient centrifugation. Further, endoth

9、elia cells were purified by certain drugs, followed by identified by CD31 and GFAP immunofluorescence staining. The expression of Claudin-5 was detected using immunofluorescence staining with anti-Claudin-5 antibody.RESULTS AND CONCLUSION: Mouse BMECs grew and arranged in spiral or cobblestone-like.

10、 Immunofluorescence staining showed that the purity of BMECs reached above 99% and Claudin-5 was highly expressed. In conclusion, a simple method of easy accessibility is developed to obtain highly purified primary mouse BMECs.Subject headings: Endothelial Cells; Cells, Cultured; Fluoroimunoassay; T

11、issue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 81501095; the Six Talent Peak Project of Jiangsu Province, No. 2014-WSN-034Cite this article: Zhang ZH, Chen C, Chen H, Cui GY, Hua F. Isolation and culture of primary microvascular endothelial cells from m

12、ouse brains. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(51):7666-7671.Zhang Zuo-hui, M.D., Associate chief physician, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurology of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, ChinaCorresponding

13、 author: Hua Fang, Professor, Chief physician, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurology of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China7669ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障、血脑脊液

14、屏障以及神经血管单元的重要组成部分。内皮细胞通过紧密连接，形成完整的内皮层，保护脑和脊髓不易受到内、外界环境中各种物理、化学因素的影响，而维持相对稳定的状态。内皮细胞可以表达多种转运体(Transporters)1-4，如营养物质的转运体葡萄糖转运体、氨基酸转运体和寡肽转运体等5-7；药物的转运体多药耐药蛋白等8-9，这些转运体可以把药物或者大分子的营养物从内皮细胞的管腔侧或脑组织侧转移至另一侧，起到控制物质交换和药物代谢的作用。如转运体渗透性糖蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白1可以把淀粉样蛋白从脑组织中转运至血液中10-16；P-糖蛋白转运体把多种抗癫痫药物主动泵出脑组织是药物难治性癫痫的主要

15、原因之一17-20。因此，在多种神经系统疾病中，如阿尔茨海默病、脑血管淀粉样变性以及癫痫等疾病的研究领域中，内皮细胞的转运功能是研究热点。其次，内皮细胞还具有神经营养作用，可以分泌脑源性神经生长因子、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子，促进神经发生、增加突触可塑性、促进胶质细胞增生、神经修复21-23。再次，内皮细胞还可以通过表达分泌细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子、单核细胞趋化蛋白，调节炎症反应24-27。因此，脑微血管内皮细胞在神经科学研究中，是一个重要的工具细胞。目前，对于原代脑微血管内皮细胞的分离培养，国内外通常采用酶消化法、筛网法结合免疫磁珠分选法或药物纯化法28-29，但是一直存

16、在纯度不高、产量低、操作步骤繁琐、费时、费力等问题。而不同种系来源的脑血管内皮细胞系，虽然容易获得，但由于其经过遗传改造，在某些生物学性状和表型上，有别于原代内皮细胞，无法完全模拟血脑屏障中内皮细胞的形态结构和功能。实验在总结借鉴现有原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法的基础上，探索出了一种简便易操作的高纯度、高产量原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 单一样本观察。1.2 时间及地点 实验于2015年10至12月在徐州医科大学神经病学实验室完成。1.3 材料实验动物：6只6-8周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半，由徐州医科大

17、学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2012-0001。试剂和仪器：100x青-链霉素(Corning，30-004)；IMEM (Gibco，21056)；内皮细胞生长补充物(Millipore， 02-102)；谷氨酰胺(Lonza，17-605F)；抗坏血酸(Sigma，A4403)；肝素(Sigma，H3393)；木瓜蛋白酶(Worthington，LS003119)；乙二胺四乙酸二钠EDTA(Sigma，E5134)；二巯基乙醇(Sigma， M3148)；L-半胱氨酸(Sigma，168149)；牛血清白蛋白(Fisher Scientific，9048-46-8)；鼠尾型

18、胶原(Corning，354236)；嘌呤霉素(Thermo Fisher，A1113802)；0.05%胰蛋白酶(Corning，25-051)；多聚甲醛(Sigma， P6148)；大鼠源Anti-CD31抗体(Millipore，CBL1337)；兔源Anti-GFAP 抗体(Life technologies，180063)；兔源Anti-claudin-5(Abcam，ab15106)、Alexa Fluor488羊抗大鼠荧光二抗(Life technologies，A11006)；Alexa Fluor568羊抗大鼠荧光二抗(Life technologies，A11077)；Al

19、exa Fluor488羊抗兔荧光二抗(Life technologies，A31566)；含DAPI的荧光封片剂(Vector，H-1200)；MTT(Sigma，M2128)；DMSO(Sigma，156914)；激光共聚焦显微镜(Olympus，FV-10i)。1.4 实验方法1.4.1 包被细胞培养板、配制内皮细胞培养基 配制型胶原溶液(801 L 型鼠尾胶原、57 L乙酸溶于50 mL PBS)，0.22 m滤器过滤除菌。6孔板每孔加入1.5 mL 型胶原溶液，37 孵育2 h。使用前，用PBS冲洗培养板3次。50 mL内皮细胞培养基：F12培养基44 mL，FBS 5 mL，100

20、x青-链霉素500 L，内皮细胞生长补充物1.5 mg，肝素250 U，抗坏血酸125 g，谷氨酰胺500 L。1.4.2 激活木瓜蛋白酶 由于木瓜蛋白酶的活性容易受氧化剂和重金属的抑制，因此，在使用木瓜蛋白酶之前，需要使用还原剂二巯基乙醇和重金属螯合剂EDTA将其完全激活。具体配制方法如下，25 mL木瓜蛋白酶激活溶液：含有青-链霉素的MEM 25 mL，BME 0.12 L， L-半胱氨酸 15.145 mg，EDTA 10.235 mg。木瓜蛋白酶工作浓度为100 U/mL。使用前用0.22 m孔径滤膜过滤除菌。1.4.3 脑微血管内皮细胞的分离培养 用乙醇喷洒消毒C57BL/6小鼠头部

21、，颈椎脱臼法处死小鼠，断头取脑，置于装有预冷的Hanks液的10 cm培养皿中。余下步骤在生物安全柜中操作，以Hanks液冲洗鼠脑3遍，用无菌刀片将脑组织切成小块，加入IMDM培养基，将脑组织混悬液转移至15 mL离心管中，1 200 r/min，离心5 min。弃去上清液，向脑组织中加入5 mL木瓜蛋白酶，混合均匀后，放入37 培养箱中，孵育70 min。孵育结束后，将脑组织混悬液转移至10 cm培养皿中，先以19号针头对组织进行匀浆研磨5-7次，然后再以21号针头进一步研磨。注意在每一次研磨操作时，确保将组织完全吸入注射器，然后再完全挤出，以避免组织研磨不均和研磨过度。研磨后，组织悬液呈粉

22、红色匀浆。将脑组织匀浆转移至15 mL离心管中，再加入22%BSA，混合均匀。 2 600 r/min，离心10 min。离心后，离心管上部的粉黄色部分为髓鞘组织，而微血管段和分离的细胞位于离心管底部，中层为BSA。倾斜离心管，小心吸出髓鞘组织和中层的BSA。以1 mL ECGM重悬微血管段和细胞，将其转移至15 mL离心管中，加入1 mL ECGM，1 200 r/min离心洗涤5 min。重复洗涤1次。加入8 mL ECGM重悬细胞，接种于预先使用型胶原包被过的细胞培养板中，每孔2 mL。第2天，使用F12冲洗细胞3-6次，以除去组织和细胞碎片，加入ECGM培养基继续培养。1.4.4 脑微

23、血管内皮细胞的纯化 第2天光镜下观察细胞贴壁良好，加入嘌呤霉素，使其终浓度分别为2 mg/L和4 mg/L，保留嘌呤霉素60 h，然后更换为常规ECGM培养基。1.4.5 脑微血管内皮细胞纯度鉴定 血管内皮细胞在分离培养的过程中，容易混杂有星形胶质细胞。因此使用免疫荧光检测内皮细胞标志物CD31以及星形胶质细胞标志物GFAP，来鉴定原代细胞培养中内皮细胞的纯度。高压灭菌细胞爬片，置于24孔培养板中，型胶原包被爬片37 孵育2 h，PBS洗涤3次，将原代细胞以5×104/孔的浓度接种于爬片上。培养2 d后，吸尽培养基，PBS冲洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定5 min。PBS洗3次，每

24、次5 min。以含有0.1%Triton、5%BSA的PBS室温封闭1 h，以含有0.05% Triton、2.5%BSA的PBS稀释一抗anti-CD31抗体、anti-GFAP，抗体稀释浓度1250，加于玻片上，4 过夜。第2天，以PBS洗3遍，每遍5min。以含有0.05% Triton、2.5%BSA的PBS稀释荧光二抗，二抗稀释浓度1500，加于玻片上，室温避光孵育1 h。PBS洗3遍，每遍5 min。在载玻片上滴加20 L 含有DAPI的荧光封片剂，小心夹出细胞爬片，倒扣于载玻片上。荧光显微镜下观察。1.4.6 脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白鉴定 内皮细胞表达紧密连接是构成完整血脑屏

25、障的前提，因此，实验使用细胞免疫荧光检测紧密连接蛋白Claudin-5的表CBAA490nm1.00.20图1 原代脑血管内皮细胞培养不同培养阶段的光镜照片Figure 1 Light microscope observation of the primary brain endothelial cells at different stages of culture图注：A为第1天(×20)；B为第3天(×20，箭头所示为内皮细胞沿着微血管段长出)；C为第5天(×10)。第1天指细胞分离培养的次日。0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 图2

26、MTT法测定原代培养细胞的生长曲线Figure 2 Growth curves of primary cultured cells detected by MTT assay图注：a代表使用2 mg/L嘌呤霉素处理的原代内皮细胞，b代表4 mg/L嘌呤霉素处理的原代内皮细胞。2 mg/L嘌呤霉素处理的细胞表现出更强的细胞生长增殖能力。CD31 DAPI Merge 2 mg/L4 mg/LGFAP DAPI Merge 2 mg/L4 mg/L图3 原代细胞培养CD31的免疫荧光染色结果(标尺=100 m)Figure 3 Immunostaining for CD31 in primary

27、cultured cells (scale bar=100 m)图注：绿色荧光为CD31，蓝色荧光为DAPI。2 mg/L和4 mg/L嘌呤霉素组，几乎所有细胞都表达内皮细胞特异性标志物CD31，未见表达GFAP的星形胶质细胞。图4 原代细胞培养GFAP的免疫荧光染色结果(标尺=100 m)Figure 4 Immunostaining for GFAP in primary cultured cells (scale bar=100 m)图注：红色荧光为GFAP，蓝色荧光为DAPI。CD31阳性细胞率达99%以上，GFAP阳性细胞率低于1%。图5 原代细胞培养Claudin-5的免疫荧光染色

28、结果(标尺=50 m)Figure 5 Immunostaining for Claudin-5 in primary cultured cells (scale bar=50 m)图注：绿色荧光为Claudin-5，蓝色荧光为DAPI。培养的原代细胞在生长密度较高时，广泛表达紧密连接。达。在细胞长满培养器皿底部的80%-90%时，使用一抗anti-Claudin-5(稀释浓度为1200)，Alexa Fluor 488羊抗兔荧光二抗(稀释浓度为1500)鉴定细胞紧密连接的表达。1.4.7 MTT法监测细胞生长增殖速度 取P3代的脑微血管内皮细胞接种于96孔板，细胞密度为每孔5 000个细胞，

29、每隔24h，选取3孔细胞，测定细胞活力。每孔加入10 L MTT(5 g/L)，37 孵育4 h，吸取培养基，加入100 L DMSO振荡10 min，于490 nm检测各孔的吸光度值。1.5 主要观察指标 光镜下细胞形态；细胞纯度鉴定；紧密连接鉴定。2 结果 Results 2.1 光镜下细胞形态 如图1所示，分离培养细胞的次日(第1天)，可以观察到细胞及血管段贴壁，第3天可见大量内皮细胞沿着微血管段长出，呈旋涡状、铺路石状生长。2 mg/L嘌呤霉素处理组于第5天可以长满细胞培养板，4 mg/L嘌呤霉素处理的细胞约需7 d长满细胞培养板，见图2，2 mg/L嘌呤霉素处理的细胞表现出更强的细胞

30、生长增殖能力。2.2 细胞纯度鉴定结果 细胞免疫荧光的结果见图3，2 mg/L和4 mg/L嘌呤霉素组，几乎所有细胞都表达内皮细胞特异性标志物CD31，未见表达GFAP的星形胶质细胞，见图4。取10个独立视野进行CD31阳性细胞计数，计算CD31阳性细胞率，重复3次原代培养，CD31阳性细胞率达99%以上，GFAP阳性细胞率低于1%。2.3 紧密连接鉴定结果 免疫荧光结果见图5，培养的原代细胞在生长密度较高时，广泛表达紧密连接。3 讨论 Discussion由于培养方法复杂、纯度低、产量少，原代脑血管内皮细胞的分离培养一直是一个制约体外实验的关键因素。实验采用的分离培养方法，操作步骤相对简单，

31、所获得的原代脑血管内皮细胞纯度高、生长增殖能力强，且广泛表达紧密连接蛋白，具有良好的屏障功能。实验方案中的几点注意事项：动物年龄的选择：实验选择的是6-8周的小鼠，作者曾尝试选用月龄较大的小鼠，发现其细胞增殖活力相对下降，细胞在体外生长、增殖缓慢。亦尝试使用新生鼠，其增殖活力和6-8周的相似，但因其脑体积相对较小，获得细胞数相对较少。细胞冲洗的时机：细胞接种于培养板后，细胞及血管段逐渐贴壁，但是仍有部分组织和细胞碎片悬浮于培养液中，这些不能贴壁的细胞和组织将趋于死亡、崩解，释放一些酶类以及炎性产物，损伤存活细胞。因此适时将其清除，有利于维持良好的细胞生长环境。但若冲洗过早，将会丢失未贴壁的内皮

32、细胞和微血管段。本实验观察发现，在细胞培养的第天内皮细胞和微血管段已经基本贴壁，因此培养次日进行细胞冲洗。吹打研磨：在使用不同口径的注射器针头进行研磨、匀浆时，需避免吹打、匀浆过度，以降低细胞产量。实验中使用22%BSA的目的为替代Percoll离心分离内皮细胞，简便、快捷、易操作。嘌呤霉素的浓度和时间：嘌呤霉素具有抑制蛋白质合成的作用，内皮细胞因表达多耐药蛋白1(Multidrug resistance protein，MDR1)，可以有效地将嘌呤霉素泵出细胞外，得以存活生长。其他细胞会因嘌呤霉素的抑制蛋白质合成作用，而逐渐死亡，因此，在细胞培养基中添加嘌呤霉素，起到纯化内皮细胞的作用。以往

33、文献中多采用4 mg/L的浓度30，本实验中观察到此浓度的嘌呤霉素可以纯化内皮细胞，但是会影响内皮细胞的增殖活力，导致细胞增殖缓慢、产量下降。而2 mg/L的嘌呤霉素对内皮细胞的纯化能力与 4 mg/L嘌呤霉素相当，但对细胞的增殖活力影响较小。其次，嘌呤霉素的加入时机也至关重要。本实验曾尝试在P1代(第次传代后的细胞)细胞中加入嘌呤霉素，结果发现，所有细胞均漂浮死亡。这提示原代内皮细胞在体外培养的过程中，MDR1表达降低31。本文提供了一种分离培养脑微血管内皮细胞的方法，步骤详尽、可操作性强、重复性好，为更好的建立、模拟体外血脑屏障模型打下良好的基础。作者贡献：设计为第一作者和通讯作者，实施为

34、全体作者，评估为通讯作者。利益冲突：所有作者共同认可文章内容无相关利益冲突。伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Mehrotra D，Wu J, Pa

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