现代分子生物学第五章课件_图文

1、 5.54 基因位图克隆法(Map based cloning 图位克隆(map-based cloning又称定位克隆(positional cloning，1986年首先由剑桥 大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进 行，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息，而是通 过分析突变位点与己知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。实现基因图 位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术 1995, 澳大利亚科学家首次发表蛋白质组 (Proteome. 2001年的Science杂志已

2、把蛋白质组学(Proteomic列为六大研究热 点之一，其“热度”仅次于干细胞研究名列第二 . 蛋白质组学技术平台 结构蛋白质组学 样品制备 蛋白质信息 功能蛋白质组学 蛋白质鉴定 细胞作图 蛋白质互作 三维结构 （X-ray， NMR） 细胞定位 译后修饰 预测/模拟 蛋白质组学（Proteomics 是对蛋白质特别是其结构和功能的大规 模研究，是在90年代初期，由Marc Wikins等首先提出的新名词。 蛋白质组学的现实意义 1、蛋白质是生物特征的直接体现者. 2、基因组学的补充。蛋白质组有动态性，1gene1Protein. 蛋白质组学研究的关键技术包括质谱分析，X-射线晶体衍射，核磁

3、 共振和凝胶电泳。 细胞/膜/复合体 大小排组层析 离子交换层析 高效液相层析 疏水层析 单双向凝胶电泳 流体/毛细管电泳 亲和捕获 质谱 Edman降解 信息学 氨基酸序列分析 5.61 双向电泳技术 5.62 蛋白质印迹法 Western blotting / Immunoblotting 5.63 蛋白质的质谱分析技术(Mass Spectrometry, MS 质谱是带电原子、分子 或分子碎片按质量的大 小顺序排列的图像。 质谱仪是一类能使物质 质谱仪 离化成离子并通过适当 的电场、磁场将它们按 空间位置、时间先后或 者轨道稳定与否实现质 量比分离进行检测分析 的仪器。 质谱技术种类

4、1 电喷雾质谱技术(Electrospray ionization Mass Spectrometry，ESIMS 是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶 剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电 荷或多电荷离子的形式进入气相 。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降 低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以 根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用。 2 基质辅助激光

5、解吸附质谱技术(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization， MALDI 基本原理是将分析物分散在基质分 子中并形成晶体，当用激光照射晶体时 由于基质分子经辐射所吸收的能量，导 致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶 体升华，致使基质和分析物膨胀并进入 气相。MALDI所产生的质谱图多为单电 荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和 蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI 产生的离子常用飞行时间检测器来检 测，理论上讲，只要飞行管的长度足 够，检测器可检测分的质量数是没有上 限的，因此质谱很合适对蛋白质、多肽、 核酸和多糖等大分子的研究。 3 快原子轰击质谱技术

6、(Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry，FABMS 一种软电离技术，是用快速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅 出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别 适于多肽和蛋白质的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而 可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMSMS串联技术的应用可以提供 样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。 4 同位素质谱技术 是一种开发和应用比较早的技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域 的应用只是近近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力，该化 合物又易于用同位素标示，人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同 位素的含量以达到检测该病