常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

1、常用的半抗原与蛋白偶联方法简介公司标准化编码QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有瘦基或可竣化的半抗原的偶联）1、混合酸酉干法,也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的竣基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酎 （mixed acid anhydride）,然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋吟（MIT）与B -半乳糖昔酶偶联的混合好法1、5. 8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10 度搅拌反应30分钟。2、酶用 2ml 5

2、0 m mol/L Na2c03 溶解。3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为,q然后4度过夜。4、过 sephadex G-25 层析柱，柱用含 aCl 100m mol/L、MgC12 10 m mol/L、2-疏基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶 的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA % （w/v）、NaN3 %（w/v）的缓 冲液中。碳化二亚胺法制备3, 3, 5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、?flX EDC lOOmg ,用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液）2、？?取3,

3、 3, 5-三碘甲腺原氨酸25mg ,用L NaOH溶液2ml溶解（II液）3、？取血蓝蛋白（lemocyanin） 25mg,溶于 10mmol/L PBS （）液中（III 液）4、？?将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下）5、？?室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、？?4度搅拌12小时7、?静置10小时（4度）8、？?有蒸谪水使之充分透析（约48小时），得免疫原。孕酮与与B -半乳糖甘酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、？?用二垩烷（dioxane）溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。2、?加羟琥珀酰亚胺（N-hydroxysucci

4、nimide） 100 m mol/L 和 DCC （二环已 基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。3、？?用簿层扫描方法纯化（氯仿：水二9： 1）4、？?按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓 度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。5、?（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤1、?用mol/L HC1溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。2、？?滴加l%aN02（过量），4度持续搅拌。NaN02的加入量可用淀粉-碘 化物试纸或在白色磁砖上加1%淀粉和50nl mol/L KI进行监控。游离亚硝酸

5、可 将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。3、？?溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。4、？?用、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。5、？?边搅拌，边加入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量现象)，调 节pH到。6、？?冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH至上7、？?用PBS透析2天8、？?-20度保存(浓度为20mg/mL)双功能的酰亚胺酯(imidate esters)可以氨基反应，形成眯。例如：用二 甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)将去甲基三正喋吟 (desmethylmortriptyl ine)与 B -半乳糖甘酶偶联。应用双功能酰亚胺酯(

6、imidate esters)制备去甲基三正喋吟-与B 一半乳糖昔酶标记特的操作步骤1、？?用含5% (W/V) N-乙基吗咻的无水中醇,在室温下溶解570ug去甲基 三正喋吟和488ug二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide) (A液)2、？?取与F-半乳糖昔酶100 ug,溶于的100 m mol/L碳酸缓冲液(含 MgC12 10m mol/L, 2-疏基乙醇 10 m mol/L (B 液)3、？?将人液倒入B液。4、？?20 度反应 90 分钟后，加含 NaCl 100 m mol/L, MgC12 10 m mol/L 和2-疏基乙醇10 m mol/L、的Tris

7、-醋酸缓冲液(50m mol/L) lml,终止反 应。5、？?过sephadex G-25,去除小分子物质，得酶标记物(约75%的酶与 半抗原结合，但用三正喋吟代替去甲三正喋吟(demethylmortriptyline )进行 偶联，则只有15%的酶与之结合。(三)含疏基半抗原的偶联可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将我体蛋白用滨乙酰胺 (bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在的醋酸缓冲液中，通过过氧 化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。(四)含羟基的半抗原偶联醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为竣基的操作步骤1、?15g 2, 2, 2-三氯乙醇(2

8、, 2, 2-trichloroethanol) , 12g 琥珀酸酉千 (succinic anhydride)和 三乙基胺(triethylamime)用 100 ml 乙酰乙酯溶 解。2、？?加热回流1小时。3、？?减压蒸饰去溶剂，残余物用5% aHC03水溶液溶解。4、？?用乙醛洗涤两次，然后用H2s04进行s酸化(pH到).5、？?用水洗涤固形物(为三氯乙基半琥珀酸酯)两次，用氯仿-已烷使其 结晶(产量约75%,熔点88-89度)6、?取 半琥珀酸酯溶于 亚硫酰氯(thionyl chloride)中,65度加热30 分钟。7、？?减压蒸发，干燥1小时(高度真空条件下)。8、？?将上

9、述产生(2, 2, 2-三氯忆基琥珀酰氯)溶于15ml X,2二甲基- 乙酸乙酰胺（N, N-dimethylethylacetamide）中,室温搅拌反应2小时。9、？?65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶-5- 酯约84%,熔点160度）。10.用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥 珀酸酯，这样引和的竣基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。半抗原用NaI04氧化其中的糖昔醇后再与蛋白质偶联的操作步骤1、?20mg腺昔溶于lml 100m mol/L NaI04溶液中，4度避光反应30分 钟。2、？?加1滴乙二醇（得A液）3、?将人液加入到半乳糖昔酶

10、液（20mg/ml, ffl 150m mol/L NaCl, 10m mol/L MgC12水溶液溶解，用3%K2c03调节pH至）中4、？?4度反应2小时，期间不断调节5、？?力口入临时配制的50 mg/ml N&B04溶液，用量为反应体积的1/10。 4 度反应过夜。6、？用含有 MgC12 10m mol/L, 2-疏基乙醇 10 m mol/L. NaCl 100 m mol/L的50 nl mol/L磷酸缓冲液透析（更换透析液数次）（五）含酮基或酮基半抗原的偶联是将酮基经羟胺类化合物处理变成的类化合物，再进一步将后类化合物中 的羟基，衍变成竣基化合物，再进一步进行含按基半抗原的偶联

11、操作。这类羟 胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxy acetic acid或竣甲氧胺 carboxymethoxyl amine 或者盐酸羟胺酮基的类固醇分子中引入竣基的操作步骤1、？?在200ml乙醇中，加入0-（按甲基）羟胺（0-（carboxyl） hydroxylamine）和酮基半抗原,使其浓度分别为10m mol/L和4nl mol/L2、？?加热回流90分钟3、？?旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml,用乙醛抽提4、？?用水洗涤乙酸抽提物，用2s04干燥成白色粉末。（六）、其他半抗原的偶联虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直 接用来与载体蛋白偶联

12、。制备雌二醇-6-用的操作步骤a、？?雌二醇二醋酸盐的制备1、?lg雌二醇溶于14ml-咤及醋酉干中2、？?加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。3、？?收集白色晶体，得产物约（熔点126到127度）b、？?雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备4、雌二醇二醋酸盐，滴加冰醋酸溶解后加含Cr03的含水冰醋酸 （H20:Hac=：5、室温搅拌1小时，静置24小时6、用水稀释，用乙醛提取4次7、用蒸储水洗2次8、减压蒸馀，得结晶油状渣物。9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg10、m 11ml无水乙醇溶解粗制品，再加冰醋酸及吉纳你特T试剂(Girad T),回流1小时。11、冷却后，用冰致冷的蒸储水稀释

13、，用LaOH调节pH至12、用乙醛抽提3次，弃去乙醛。13、水层用浓盐酸酸化(盐酸终浓度为lmol/L).14、室温静置2小时。15、用乙醛抽提3次。16、合并乙醛抽提液，用L碳酸钠溶液洗1次，用蒸储水洗3次。17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。18、加7ml酷酊，回流20分钟。19、冷却后倾入用冰致冷的蒸储水中，然后过滤、干燥得产物约176mg (熔点为162-166度)c、？?二醇-6-酮的制备20、m 20%的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐 (176mg),在室温下于氮气中水解24小时。21、加蒸储水稀释，用乙醛抽提3次。22、在乙醛提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg(熔 点为278-282度)d、？?雌二醇-6-胎的制备23、取雌二醇-6-酮50mg