除草剂丁草胺对高产水稻土微生物群落功能多样性的影响

1、除草剂丁草胺对高产水稻土微生物群落功能多样性的影响作者：张仕颖 单位：云南农业大学资源与环境学院期刊: 生态环境学报 2013,22（5）：815-819目录1. 背景介绍2. 材料和方法3. 结果和分析4. 结论介 绍 1. 丁草胺的概况： 丁草胺是亚洲生产和应用最广泛的除草剂，与乙草胺和草甘膦并称我国三大除草剂，每年用量超过8000 t，且呈持续增加的趋势。丁草胺主要应用于水稻田，对禾本科杂草有较好的防除效果，但由于使用量大，且直接毒土，不可避免地会在土壤和环境中残留，破坏土壤微生物群落结构，影响水稻产量。 丁草胺在环境中的残留污染主要有三种情况：一是丁草胺随生产废水、排灌水及降水的纵向淋

2、溶和横向扩散会造成地表水和地下水的污染；二是丁草胺会对生态系统中的植物、动物和微生物产生不利影响，从而影响到整个生态系统的正常运转；三是丁草胺具有致突变性和遗传毒性，能通过食物链和生物富集将毒性逐级传递并不断扩大，最终影响到人类健康。因此，丁草胺在生态环境中的安全性问题已经逐渐引起人们的关注，深入了解丁草胺的环境生态效应显得极为重要。2. 高产水稻区概况高产水稻区概况 ： 云南永胜涛源乡是保持我国水稻小面积超高产纪录的特殊生态区，1983年常规稻“桂朝2号”在涛源创下亩产1075.4 kg的全国高产纪录，使我国首次实现单季水稻亩产超吨粮的突破；2001杂交稻“特优175”验收亩产达1185.5

3、 kg，超级稻“优明86”验收亩产达1196.5 kg，双双打破印度亩产1184.8 kg的世界水稻纪录；从2004年到2006年，涛源连续三年创造1亩以上面积水稻单产突破1200 kg大关的历史性突破，“协优107”亩产达1287 kg。光照、温度和当地优越的土壤微环境是造成涛源水稻频频高产的重要生态因素。 涛源特殊生态区常年使用丁草胺作为水稻选择性芽前除草剂，大量施用的除草剂究竟会对土壤微生物群落结构造成多大影响成为研究者关注的焦点。 本试验采用BIOLOG ECO微平板，通过测定土壤微生物对单一碳源的利用能力和利用程度，研究不同浓度丁草胺对高产水稻土微生物群落功能多样性的影响。 BIOL

4、OG碳素利用法是由美国BIOLOG公司于1989年开发成功的一种用于微生物纯种鉴定的研究方法。BIOLOG方法的原理是：微生物在利用碳源的过程中会产生自由电子，自由电子可引起四唑盐染料发生氧化还原显色反应，由于微生物对不同碳源的利用能力很大程度上取决于微生物的种类及其代谢活性，从而达到鉴定纯种微生物或比较分析微生物群落结构的目的。 ECO微平板是BIOLOG碳素利用法中以碳源利用能力为基础的描述微生物群落功能特征的定量分析方法。ECO微平板共96个孔，每32孔为一组重复，包含1个对照孔和31个反应孔。对照孔中加入水和指示剂，反应孔分别加入31种单一碳源和指示剂。将微生物接种到ECO微平板后，各

5、孔中微生物利用碳源底物，发生氧化还原反应，使指示剂变色，然后根据反应孔中颜色变化的吸光值来指示微生物对 31 种不同碳源的利用情况，得到土壤微生物特有的“代谢指纹”，从而反映微生物群落功能代谢能力的差异。此方法灵敏度高，无需分离培养纯种微生物，可最大限度保留微生物群落的原有代谢特征，且操作简便，数据量大，在研究空间及时间尺度上微生物群落变化方面得到广泛应用。研究思路：材料和方法1. 供试药品 丁草胺，上海升联化工有限公司生产，农药登记号：D20091403，产品标准号：HG3292-2001，施用方法：药土法。2. 土壤含水量测定 称取30-40 g（精确到0.01 g）新鲜土样置于培养皿中，

6、放入110烘箱烘烤6 h，取出称重；之后重新放回烘箱继续烘烤，每隔30 min重复称重一次，直至恒重，设置三个重复。土壤含水量计算公式为：其中，m0表示烘干前样品重，g；m1表示烘干后样品重，g。100%0102mmmWOH3. 丁草胺处理试验设计 丁草胺的合理施用标准为有效成分浓度747-1278 g/hm2（GB/T 8321.1-2000），折算合0.216-0.370 mg/kg干土，本研究取中间浓度0.30 mg/kg干土作为100%推荐剂量。称取相当于500 g干重的新鲜土样，加入超纯水使其含水量为田间最大持水量的60%，在室内模拟条件下，添加以超纯水稀释的丁草胺，使其在土样中的有

7、效成分浓度分别为50%推荐剂量(0.15 mg/kg，简称B15)、100%推荐剂量（0.30 mg/kg，简称B30）和500%推荐剂量（1.5 mg/kg，简称B150），搅拌均匀，另设不加丁草胺的处理为对照（0 mg/kg，简称CK），每个处理3个重复。所有处理密封，置于恒温培养箱（251）中避光培养，于药剂处理后的7、15、30、45 d 取样测定，每隔2-3 d用差减法补充水分以调节含水量。4. 土壤微生物功能多样性测定方法ECO微平板的测定方法参照Garland（1991），具体步骤为： 0.1 mol/L磷酸缓冲液：KH2PO4 /K2HPO4，pH 7.0，分装至250 mL三

8、角瓶中，每瓶90 mL，121灭菌备用； 0.85%生理盐水：NaCl 8.5 g，蒸馏水1000 mL，分装至玻璃试管，每管9 mL，121灭菌备用； 称取相当于10 g干土重的处理土样，加入90 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液中，180 r/min振荡30 min，静置10 min； 取土壤浸出液上清1 mL，加入9 mL 0.85%生理盐水，混匀，梯度稀释成10-3土壤菌悬液； 用移液器接种土壤菌悬液至ECO微平板，每孔150 L，每个样品三个重复； 25恒温培养箱温育7 d，在培养24、48、72、96、120、144、168 h后用BIOLOG自动读板仪读取590 nm波长下的吸

9、光值。 5. 数据处理 试验数据使用SPSS 17.0软件处理，采用单因素（one way ANOVA）方差分析和LSD法进行多重比较（0.05）。3. 数据处理 微生物代谢活性采用微平板每孔颜色平均变化率（Average Well Color Development，AWCD）描述，采用Shannon指数（Shannon index）和Simpson指数（Simpson index）表征土壤微生物群落功能多样性（表4-1）；使用SPSS 17.0软件处理AWCD值、Shannon指数和Simpson指数计算结果，采用单因素（one way ANOVA）方差分析和LSD法进行多重比较（0.05

10、）。结果与分析1. 不同处理微生物群落代谢活性分析 图 土壤微生物群落温育过程中AWCD值的变化 施药施药7 d，B30的的AWCD值明显高于其它处理，其次为值明显高于其它处理，其次为B15。B150和和CK差别不明显，说明差别不明显，说明中低剂量丁草胺可刺激微生物生中低剂量丁草胺可刺激微生物生长，高浓度丁草胺影响不显著；长，高浓度丁草胺影响不显著；各处理均在温育72-120 h期间表现出较强的碳源利用能力。 施药施药15 d，B30仍然保持最强的代谢活性，仍然保持最强的代谢活性，B15在温育在温育96 h后降至后降至CK以下，以下，B30在温育在温育168 h时与时与CK持平，而持平，而B1

11、50始终保持相对较低的代谢状况，说明始终保持相对较低的代谢状况，说明随着处理时间延随着处理时间延长，中低浓度丁草胺对微生物的刺激作用逐渐消退，高浓长，中低浓度丁草胺对微生物的刺激作用逐渐消退，高浓度则表现出抑制作用；度则表现出抑制作用； 施药施药30 d，CK表现出对碳源最强的利用能力，温育表现出对碳源最强的利用能力，温育96 h时，时，其其AWCD值与值与B15和和B30差异不明显，但比差异不明显，但比B150高出高出40.5%，说，说明明随着农药的自然降解，中低浓度丁草胺的刺激作用已不存在，随着农药的自然降解，中低浓度丁草胺的刺激作用已不存在，高浓度的抑制作用尚未解除；高浓度的抑制作用尚未

12、解除； 施药施药45 d，所有处理整体代谢活性无明显差别，随着温，所有处理整体代谢活性无明显差别，随着温育时间延长，育时间延长，B150碳源利用能力逐渐增强，说明碳源利用能力逐渐增强，说明高浓度丁高浓度丁草胺对微生物的抑制作用正逐渐消除。草胺对微生物的抑制作用正逐渐消除。 施用丁草胺会改变高产水稻土微生物群落代谢活性，中低浓度对微生物有促生长作用，高浓度有抑制作用，随着培养时间延长，促进和抑制作用逐渐减缓，直至完全消失。 小结：小结：2. 不同处理微生物群落多样性指数分析 施药7 d，除B30的Shannon指数明显偏高外，其余处理与CK均无显著差异，说明100%推荐剂量可提高微生物碳源利用能

13、力，与AWCD值分析结果一致。施药15 d，所有处理Shannon指数与CK均无显著差异，丁草胺未表现出明显影响。施药30 d，B150的Shannon指数首先显著下降。施药45 d，B30也表现出Shannon指数显著下降，据此趋势推测，若继续培养，B15的Shannon指数很可能也会下降。说明施用施用丁草胺会导致微生物群落可利用碳源种类数显著下降，施药浓度越高，发生丁草胺会导致微生物群落可利用碳源种类数显著下降，施药浓度越高，发生微生物群落可利用碳源种类数减少所需时间越短。微生物群落可利用碳源种类数减少所需时间越短。 施药7 d，除B30的Simpson指数明显偏低外，其余处理与CK均无显

14、著差异，说明100%推荐剂量可提高微生物碳源利用能力，与AWCD值和Shannon指数分析结果一致。施药15 d，B150最早出现Simpson指数的明显升高，与CK达到差异显著，说明高浓度处理最早引起微生物碳源利用能力集中，可利用碳源种类数减少。施药30 d，B150的Simpson指数进一步提高，比CK高出33.3%，达到差异显著；而B30和B15与CK虽未达到差异显著，但其Simpson指数也表现出升高的趋势，比CK分别高出15.9%和11.6%。施药45 d，B30的Simpson指数与CK达到差异显著，说明中等浓度处理也引起了微生物碳源利用能力集中。据此趋势推测，若继续培养，B15很

15、可能也会引起微生物碳源利用能力集中。施用丁草胺会导致微生物群落碳源利用能力集中，施药浓度越高，施用丁草胺会导致微生物群落碳源利用能力集中，施药浓度越高，发生微生物群落碳源利用能力集中所需时间越短。发生微生物群落碳源利用能力集中所需时间越短。 两个多样性指数分析结果均表明，施用丁草胺会对高产水稻土微生物群落碳源利用能力产生不利影响，施药浓度是导致微生物群落碳源利用能力集中、可利用碳源种类数减少的直接原因，且施药浓度越高，发生微生物群落碳源利用能力减弱所需时间越短。小结：3. 不同处理微生物碳源利用特征主成分因子分析 施药7 d，主成分因子PC1和主成分因子PC2贡献率分别为47.14%和32.3

16、6%，累计方差贡献率79.50%；PC1能较好区分CK、B15和B30，PC2能较好区分CK和B15，说明施用丁草胺会造成高产水稻土微生物群落碳源利用能力的差别，B15和B30首先获得响应，考虑到PC1和PC2贡献率不同，综合评价应为综合评价应为B30变化最显著变化最显著。 施药15 d，主成分因子PC1和主成分因子PC2贡献率分别为47.71%和32.43%，累计方差贡献率80.14%；PC1能较好地将三个农药处理与CK区分开，PC2能较好区分CK、B30和B150，说明随培养时间延长，高浓度处理微生物碳源利用能力也开随培养时间延长，高浓度处理微生物碳源利用能力也开始发生改变，但不及中低浓度

17、处理变化明显。始发生改变，但不及中低浓度处理变化明显。 施药30 d，主成分因子PC1和主成分因子PC2贡献率分别为41.15%和29.92%，累计方差贡献率71.06%；PC1能较好地将CK与其他三个处理区分开，PC2则只能明显区分CK和B150，说明丁草胺对微生物碳源利用能力的影响仍存在，但丁草胺对微生物碳源利用能力的影响仍存在，但中低浓度影响力开始减弱。中低浓度影响力开始减弱。 施药45 d，主成分因子PC1和主成分因子PC2贡献率分别为41.38%和32.38%，累计方差贡献率74.21%；PC1和PC2均能够较好区分CK、B15和B150，而无法区分CK和B30。说明随着丁草胺的自然降解，农药对土微生物碳源利用能力说明随着丁草胺的自然降解，农药对