药物分析ChP注射重组人促红素的鉴别

1、生物制品分析事例三ChP注射重组人促红素的鉴别1. 生物制品简介 生物制品（biological products）是指用微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等经加工制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。 根据用途可将生物制品分为预防类、治疗类和诊断类三大类制品，注射用重组人促红素是一种治疗类的生物制品。EPO 是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称。人体中的促红细胞生成素是由人体中肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌的一种激素类物质，能够促进红细胞的生成。由于EPO 在体内的作用非常大而天然来源

2、却十分有限(主要从贫血患者的尿中提取)1，人们便开始利用基因重组技术获得重组人促红素( Recombinant human erythropoietin, rHuEPO)，它是将人的EPO基因转入哺乳动物细胞内高效表达的能刺激红细胞生成的糖蛋白激素2，3。它由不同的糖基化体构成，各种糖基化体的区别主要表现在糖基在整个分子中所占的比例不同，它一方面能够刺激骨髓造血功能，及时有效地增加红细胞的数量；另一方面能够增强机体对氧的结合、运输和供应能力，有利于改善缺氧状态，促进肌肉中氧生成，使肌肉更有力、工作时间更长。2. 免疫印迹法 由于注射重组人促红素是一种治疗类的生物制品，生物制品一般均为免疫制剂，

3、故可以利用其生物制品的特点利用免疫学的方法的其进行鉴别，中国药典2010年版收载的对其鉴别的方法为免疫印迹法。免疫印迹法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查4。 免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）也被称作酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoeletrotransfer blot，EITB），是20世纪70年代末，发展起来的一门蛋白质多参数检测技术。由于其与早先建立的核酸印迹法southern blot相类似，所以习惯上又叫western-blot。（1）原理 经过PAGE分

4、离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 （2）基本步骤及操作免疫印迹法分三个阶段进行：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)；电转印；酶免疫定位（显色） 一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)阴离子去垢剂SDS能破坏蛋白质中的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的

5、电荷量，掩盖了各种蛋白质分子间的天然电荷差异；加入巯基乙醇使电泳的迁移率不再受原有分子形状的影响。这样蛋白质的迁移率就取决于其分子量的大小二、电转印 转印膜的顺序：两层滤纸-NC膜-SDS-PAGE胶-两层滤纸 在转印Buffer中用玻璃棒轻轻赶走当中的气泡。 滤纸 NC膜 凝胶 滤纸电转印电流大小及时间：恒流=0.8 mA/cm2 电泳2小时转印结果的检查：电泳结束后，用丽春红对NC膜预染下，观察转移效果。随后用水冲洗掉丽春红的颜色，进行封闭。 三、酶免疫定位（显色）封闭：将上述得到的NC膜，用封闭液在摇床上过夜封闭。为了防止免疫试剂的非特异性吸附。清洗：封闭时间达到后用PBST清洗NC膜3

6、次左右，每次约15分钟。一抗孵育：清洗好后，加入一抗标记2小时左右。一抗一般选择源于兔或小鼠。清洗：一抗孵育好后，再次用PBST清洗3次左右，每次约15分钟。以除去未结合的一抗。 二抗孵育：清洗好后，加入二抗标记1小时左右。二抗根据一抗的来源选择适合的羊抗兔或羊抗鼠。清洗：二抗标记好后，用PBST清洗3次左右，每次约15分钟。以去除未特异性结合的二抗。 显色放射性核素检测显色方法 辣根过氧化酶相关显色法 碱性磷酸酶法总结： SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜 过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 D

7、AB显色底物显色法显色 ECL显色法免疫印迹吸附材料用于免疫印迹的吸附材料有:合成聚合膜、纤维纸、硝酸纤维素膜和尼龙等.合成聚合膜类有:polyvinylidenedifl-uoride(PVDF )和polysulfone膜等,该 类材料操作起来有一定难度,且灵敏度、辨率均不够理想,本底染 色也较高。所以 ,目前较少使用此类材料。纸类吸附料有离子交换纸,如 DEAE 纤维素和磷酸纤维素 ( P e )纸,活化的纸有diazobenzyloxyme -th y ( DBM )和 diazoPhen ylthioehtyl(DPT )纤维素纸等,后者用于共价结合蛋白质。本底和非特异引起非特异的原

8、因主要有以下三类：膜的非特异吸附；探针与电泳带的非特异反应；转移蛋白检测的不敏感性。膜的非特异吸附过高是由于封闭不够或封闭试被污染的缘故。封闭试剂中加入非离子去污剂,如T w e e n 一2 0 可降低 非 特异吸附,进而得到较高的信一噪比。通常情况下,非特异反应来源于探纯度不够。纯化探针、提高标记物的比活性是减少此类非特异的有效方法。转移蛋白检测的不敏感性是由蛋白质和探针的离子反应不匹配造成的。如亲合素可与许多酸性蛋白结合,在亲合素一生物素系统中常常出现假阳性。将 保 温缓冲液的PH提高到9,能降低亲合素和酸性蛋白的结合,或将亲合素改用为链亲合素.降低不敏感性反应的另一种方法是采用一系列封

9、闭步骤和提高缓冲浓的 离子强度。 其基本操作过程如下图：（3）应用 在临床上, 此技术已作为诊断疾病研究观察疾病发展过程的手段之一。近来, 在自身免疫性疾病、免疫复合物基因多型性、肿瘤标志物和血液成分等研究中都有一定的应用5,6,7如通过该技术定性过敏源和IgE, 对评估和诊断过敏性疾病很有帮助。免疫斑点印迹技术更适用于大批量普查、体检和流行病学调查。 免疫印迹技术特别适于由基因工程制备的多肤等抗原所产生的抗体的筛选工作以及由重组DNA表达的蛋白质的筛选工作8。 该方法是由组织学方法衍生而来的, 所以其原理多数试剂操作程序和酶一底物系统均与免疫组化类似。反过来;免疫组化又可借助该技术的简便、实

10、用性来摸索最佳反应条件, 如抗体的交叉反应可简便地由此方法将抗原固定在硝酸纤维素膜上来确定。该技术还可用于肿瘤组织不同分化的细胞型分析以及活检组织中疾病的相关蛋白的鉴别。 生物化学应用此技术可做蛋自质结构和功能的研究以及各类酶学分析, 与各种标记技术联合起来( 如放射性同位、酶、磷酸化等) 可用于细胞膜的研究利用此技术可做膜蛋白的提纯、免疫原性检测亲和纯化特异性抗体等。3. 注射用人重组促红素的鉴别 （1）等电聚焦电泳法:使用含有pH范围为3至5的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶。取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40% pH3至5的两性电解质溶1.05ml、40% 

11、pH 3至10的两性电解质溶液0.45 ml、水13.5ml，充分混匀后，加入NNNN-四甲基乙二胺 15l和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20l（浓度应在每1 ml含0.5 mg以上），照等电聚焦电泳法进行（附录 D），同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。 （2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：要求供试品与对照品上样量大于100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，侵于BEM缓冲液中30分钟。另取与凝胶同样大小的厚滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，用EBM缓冲液浸泡。用半干胶转移仪进行转移：在电泳板上依次放上滤纸3张、硝

12、酸纤维素膜1张、电泳凝胶、湿滤纸3张，盖上电极板，按0.8A/cm2纤维素膜恒电流转移45分钟。取出硝酸纤维素膜浸入封闭液中封闭60分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体，室温过夜。硝酸纤维膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次每次8分钟。弃去液体，在加入TTBS缓冲液10ml,摇动加入适量生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体，室温过夜。硝酸纤维膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动，加入适量的亲和素溶液和生物素标

13、记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。4参考文献：1杨元生, 陈垦, 石星亮, 等. 促红细胞生成素的临床应用进展J.中华全科医学ISTIC, 2009, 7(9).2 Eschbach JW,Egrie JC, Downing MR, et al. Correction of the anemia ofEnd stage renal disease with recombinant human erythropoietin.Results ofa combined phase and clinical t rial .N Engl J Med, 1987, 316( 2) :73-78.3 Abels RI. Use of recombinant human erythropoietin in the treatment of anemia in patients who have cancer.Semin Oncol, 1992, 19(3 sup