ECSOD在大肠杆菌中的可溶性表达

1、EC-SOD在大肠杆菌中的可溶性表达朱希强，袁勤生*（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）摘要：目的在大肠杆菌中表达可溶性EC-SOD。方法将表达质粒EC-pet28a（+）转入宿主菌BL21（DE3）plysS中进行表达，在低温下培养含表达质粒EC-pet28a（+）的宿主菌BL21（DE3），通过SDS-PAGE电泳，观察其在超声上清中的表达。结果EC-SOD在BL21（DE3）plysS中表达，其量比在BL21（DE3）降低约20%，上清中有明显表达；在20和15培养时，EC-SOD在BL21（DE3）的超声上清中有表达。结论EC-SOD在BL21（DE3）pl

2、ysS中或在BL21（DE3）中低温培养，均可实现部分上清中的表达。关键词：EC-SOD；BL21（DE3）plysS；基因表达 The resolution expression of EC-SOD in supernatant by E. coliZHU Xi-qiang, YUAN Qin-sheng（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering and Institute of Biochemistry, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, C

3、hina）Abstract:ObjectiveTo express the resolution EC-SOD by E.coli.MethodsThe expression plasmid EC-pet28a（+） was transformed into BL21（DE3）plysS and BL21（DE3）containning expression plasmid EC-pet28a（+） was cultivated in low temperature. The expression of EC-SOD in supernatant was observed by SDS-PAG

4、E. ResultsThe expressed amount of EC-SOD by BL21（DE3）plysS was less about 30% than that by BL21（DE3）, and it could express in supernatant obviously; EC-SOD could also express in supernatant by BL21（DE3）which was fermented in the temperature 20 and 15.ConclusionEC-SOD can express in supernatant by BL

5、21（DE3）plysS or by BL21（DE3） fermented in low temperature.Key words: EC-SOD; BL21（DE3）plysS; gene expression人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）是目前已知的3种SOD同工酶之一，是含Cu，Zn金属离子的分泌型糖蛋白，主要在血管壁高效表达1, 有显著降血糖，降血脂及降血压作用24。EC-SOD在组织中含量极少，分离纯化相当困难，因此进行基因克隆表达具有重要意义。我室贺华君等构建了EC-SOD的表达质粒，并在BL21（DE3）中进行了表达5。表达产物均为包涵体。由于EC-SOD是四亚基的金属

6、酶，每个亚基中含有6个巯基，使包涵体复性率较低。为此我们尝试了将此基因在大肠杆菌中进行可溶性表达。首先，将EC-SOD在BL21（DE3）plysS中进行表达。BL21（DE3）plysS中含有质粒plysS，此质粒可低水平持续表达T7溶菌酶，降低了T7RNA聚合酶的量，从而使重组基因的表达水平下降。另将原工程菌在低温下培养，降低基因表达速度，使其有充分时间进行正确折叠。以上措施均使EC-SOD在菌体超声上清中获得了表达。1材料、仪器与试剂1.1实验材料EC-SOD基因工程菌由本课题组构建；质粒Pet-28a（）和菌株BL21（DE3）由中科院上海生物化学研究所吴祥甫教授提供；菌株BL21（D

7、E3）plysS由本校张慧展教授的实验室提供；种子培养基用LB培养基。1.2仪器及试剂高速冷冻离心机（BIOFUGE-28RS，德国），超声波细粉破碎机（JY92-，宁波新芝科学仪器研究所），回转式恒温调速摇瓶培养柜（HYG-，上海新蕊自动化设备有限公司）,紫外分光光度计（UV-2100，UNICO），电泳槽（HOEFER,美国），硫酸卡那霉素（Kana, ultra pure grade，750mcg/mg,Amresco分装，怡成生物公司），氯霉素（Cm, ultra pure grade，Amresco分装，怡成生物公司），异丙-D-硫代半乳糖苷IPTG（ultra pure grade

8、,Calbiochem分装，怡成生物公司），胰蛋白胨和酵母提取物（ Oxoid Ltd, England）,连苯三酚（E.Merk，BP），丙烯酰胺（进口分装，上海源聚生物科技有限公司），N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Fluka公司），其它均为国产分析纯试剂。2方法2.1表达质粒EC-PET28a（+）转化BL21（DE3）pLysS感受态细胞及转化子扩增取2L质粒（约100ng），加入90L感受态细胞，转化后，涂布含20mg/mL 氯霉素（Cm）和50mg/ mL硫酸卡那霉素（Kana）的LB固体平板。37倒置培养. 挑取单菌落, 在含20mg/ mL Cm和50mg/ mL Kana的LB固体

9、平板上划线扩增。2.2转化子双质粒快抽鉴定 用牙签蘸取少量划线扩增的菌体，依法进行质粒快抽。取5L质粒溶液，用Hind酶切鉴定，同时以plysS和EC-pet28a（+）做对照。2.3EC-SOD在BL21（DE3）和在BL21（DE3）pLysS中表达量的比较取含表达质粒的BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS甘油种各50L, 分别接种于30mL含50mg/mLKana 及20mg/mLCm和50mg/mLKana的LB培养液中，37条件下培养过夜。按1%接种量翻二级LB瓶,抗生素种类和浓度同上。约2h后,波长600nm处测吸光度A值，当A达到0.40.6时，加1.0mmol/LI

10、PTG诱导，取同量菌体，处理后进行SDS-PAGE电泳6。2.4EC-SOD在BL21（DE3）pLys超声上清中的可溶性表达按以上方法培养菌体，诱导4h后收集菌体。加Triton-EDTA缓冲液5mL，混匀后超声，功率为300W,时间5s,间隔5s,共超声90次。10000r/min离心10min，收集上清，加2 SDS缓冲液，沸水中煮沸10min，15000r/min离心10min，进行SDS-PAGE蛋白质电泳。2.5培养温度对EC-SOD在BL21（DE3）中表达量的影响37条件下LB摇瓶同时培养4瓶菌体，每瓶体积均为30mL当A600nm为0.40.6时，分别用1mmol/L IPT

11、G诱导，然后分别置30，25，20及15条件下培养，培养时间分别为5，10，20及35h, 收集不同温度培养下的相同菌体离心后加1 SDS缓冲液，沸水中煮沸10min，15000r/min离心10min，进行SDS-PAGE蛋白质电泳。2.6EC-SOD在BL21（DE3）中的可溶性表达培养条件同上。收集不同温度培养下的菌体，加入含溶菌酶（0.1mg/mL）的Triton-EDTA缓冲液4mL，超声破碎菌体，超声功率为500W，时间为5s，间隔5s。共超声100次。离心后收集上清，加2 SDS缓冲液，沸水中煮沸10min，15000r/min离心10min，进行SDS-PAGE蛋白质电泳。3结

12、果3.1转化子双质粒快抽鉴定结果见图1。转化子中所含的质粒经Hind酶切后，产生3个大小不同的片段，其大小与质粒plysS和EC-pet28a（+）单独用Hind酶切产生的片段相对应，说明该转化子中除含有质粒EC-pet-28（+）外，还含有plysS质粒，图1转化子双质粒快抽鉴定1.plysS酶切后；2. EC-pet-28a（+）酶切后；3.DNA marker；4.转化子双质粒酶切3.2EC-SOD在BL21（DE3）和在BL21（DE3）plysS中表达量的比较SDS-PAGE分析结果表明，hEC-SOD在BL21（DE3）plysS及BL21（DE3）中均可以表达，经扫描分析，显示相

13、同量菌体中目的蛋白在前者中的表达量比后者降低了约20%，说明质粒plysS起到了降低蛋白表达量的作用，结果见图2。3.3EC-SOD在BL21（DE3）plys超声上清中的可溶性表达SDS-PAGE分析结果表明，hEC-SOD在BL21（DE3）的超声上清中没有表达，在BL21（DE3）plysS菌体超声上清中有少量表达，但大部分仍以包涵体形式存于沉淀中，结果见图3。图3EC-SOD在BL21（DE3）plys超声上清中的可溶性表达1.EC-SOD在BL21（DE3）中的表达超声上清；2.标准蛋白marker；3. EC-SOD在BL21（DE3）plys超声上清中的可溶性表达；4. EC-S

14、OD在BL21（DE3）plys超声沉淀中的包涵体表达3.4培养温度对EC-SOD在BL21（DE3）中表达量的影响结果表明，随着培养温度降低，EC-SOD表达量明显降低，结果见图4。在20培养时，表达条带清晰可见，15时表达量已经很少。图4不同细胞培养温度对蛋白的影响1. 标准蛋白marker；2.30培养时的表达；3. 25培养时的表达；4. 20培养时的表达；5. 15培养时的表达3.5EC-SOD在BL21（DE3）中的可溶性表达结果表明，菌体在20培养时，超声上清中开始有EC-SOD少量表达，15培养时，超声上清中EC-SOD表达较明显，但表达量不大。结果见图5。图5EC-SOD在B

15、L21（DE3）中的可溶性表达1.标准蛋白marker；2. 30培养时的超声上清；3. 25培养时的超声上清；4.20培养时的超声上清；5.15培养时的超声上清4讨论重组基因在大肠杆菌中经常是以包涵体形式表达的，其主要原因是基因表达量太高，来不及进行正确折叠，此外，大肠杆菌中缺乏外援基因正确折叠系统，使基因的正确折叠更加困难。虽然包涵体可减少分离纯化的麻烦，但对某些基因来讲，包涵体的体外复性率较低，因此要得到足够量的折叠正确的蛋白质是十分困难的。在真核中表达目的基因可得到有活性的蛋白，但相对大肠杆菌而言，真核细胞培养本身成本较高，因此，探讨外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达具有重要意义。实现基

16、因在大肠杆菌超声上清中的可溶性表达，最常用的方法就是改变细胞培养条件，如温度和pH等，使细胞生长速度减慢，生长周期延长，相应的使基因表达时间延长，使其有足够的时间进行正确折叠。改变培养条件还可以影响蛋白合成酶的活性，从而降低蛋白质的合成量。本实验中，采用降低温度的办法，表明随着温度降低，相同菌体外源基因的表达量明显下降。对超声上清进行SDS-PAGE，结果表明，菌体在20培养时，超声上清中开始EC-SOD少量表达，15培养时，超声上清中EC-SOD表达较明显，但表达量不大。实验还表明，在超声沉淀中，仍存有大量的外源基因的包涵体。PlysS质粒对基因表达量的降低是十分明显的，而且整个过程中不影响

17、细菌的生长，在短时间内实现了基因的可溶性表达，因此比降低温度的方法更有效。在BL21（DE3）plys中表达时，因为含双质粒，操作相对较麻烦，而且表达质粒转化BL21（DE3）plys时转化率相对较低。参考文献1Oury T D, Chang L Y, Markloud S L, et al. Immunocytochemical localization of extracellular superoxide dismutase in human lungJ. Lab Invest, 1994，70：889-898.2Adachi T, Ohta H, Hirano K, et al. No

18、nenzymic glycation of human extracellular superoxide dismutaseJ. Biochem J, 1991, 279（Part）:263-267.3Griendling K K, Ushio-Fukai M. Reactive oxygen species as mediators of angiotensin signalingJ. Regul Pept, 2000, 91:21-27.4Hiroji S, Eisuke M, Tomi T, et al. Blood extracellular superoxide dismutase levels in hemodialysis lipoprotein lipase mass and free fatty acidJ. Clinical Chimica Acta, 2003, 328:113-119.5Hua-jun H, Q