脐带血NKT细胞的体外扩增及其表型研究

1、脐带血NKT细胞的体外扩增及其表型研究    作者：刘嬿，范华骅，阮鸣，高跞，聂晓绚，杨懿铭，陆华中，高峰 【摘要】  目的  建立体外有效扩增脐带血NKT细胞的方法及其表型的研究。方法  分别采用单加IL-2，及同时加IL-2和-半乳糖神经酰胺（-Galcer）的方法，从人脐带血单个核细胞（UCB-MNCs）中扩增NKT细胞。用流式细胞检测技术测定NKT细胞（TCR V24+ TCR V11+）的比例及其他表型特征。结果  UCB-MNCs在第7天时，其TCR V+ NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的（24.48&#

2、177;4.19）%，是原来的（8.74±4.37）×102倍 （ P0.01），且大多不表达NK1.1（CD161）；TCR V11+较TCR V24+高表达。结论  -Galcer对脐血NKT细胞有特异地扩增功能。以表型划分，脐血中的NKT细胞多为NK1.1-，一种新的NKT细胞亚型。        【关键词】  脐带血；NKT细胞；-Galcer；细胞表型        The proliferation of natural k

3、iller T cells in umbilical cord blood  and the different phenotype between them       【Abstract】  Objective  The first objective of this study was to establish an effective method to proliferate natural killer T （NKT） cells in umbilical cord blood （U

4、CB）.The second one was to study the phenotype.Methods  Mononuclear cells （MNCs） from UCB were cultured in the presence of IL-2 （100U/ml），with or without alpha-galcer.TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells and its other phenotypes were determined by flow cytometry.Results  After 7 day

5、s expansion，TCRV+ NKT cells from UCB-MNCs increased（8.74±4.37）×102 times，but most of them did not express NK1.1 and its TCR V11+ was higher than TCR V24+.Conclusion  Human TCRValpha24Vbeta11 double positive NKT cells can expand following the administration of alpha-galcer.Most of the

6、UCB-NKT was NK1.1-，a new subset of NKT cells.        【Key words】  umbilical cord blood；natural killer T （NKT） cells；alpha-galcer；phenotype        脐带血是一种来源广泛的新资源，其中的低免疫原性细胞正日益受到人们的关注。近研究发现，构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一种新的细胞系NKT细胞。这种细胞不

7、仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。但是，NKT细胞在脐血中的含量极少，很难用于临床研究和治疗。本文拟探讨一种高效的体外扩增脐血NKT细胞的方法，并同时分析它的表型特征，现报告如下。        1  材料与方法        1.1  试剂与仪器  Ficoll-Paque细胞分离液（Phamarcia公司）；12孔细胞培养板（Corning公司）；

8、RPMI1640培养基（Gibico公司）；KRN7000（lpha-galactosylceramide，简称-Galcer，日本麒麟公司惠赠，100ng/ml）；IL-2（R&D公司）；PE标记的TCR V24、CD161及FITC标记的TCR V11单克隆抗体（Immunotech公司）；6%羟乙基淀粉生理盐水溶液（B.Braun公司）；EPICS ELITE ESP型流式细胞仪（Beckman-Coulter公司）。        1.2  方法      &

9、#160;  脐带血单个核细胞（UCB-MNCs）的制备  新鲜采集的正常人脐带血以ACD-B抗凝血袋收集，继以体积比4：1加入6%HES液中，吹打均匀后4下静置1h，吸取中间白膜层用0.6%ACD-PBS对倍稀释，混匀后以2：1的比例加入Ficoll上层，离心（2000rpm，20min），取中间细胞环，PBS洗3次，悬浮于含10%FCS的完全培养液中。          脐带血中NKT细胞的扩增  将新鲜分离的UCB-MNCs接种于含10%FCS完全培养液的12孔细胞培养板中，每实验孔接种密

10、度为5×105/ml，分设实验组MNCs+ IL-2（5u/ml）和MNCs+-Galcer（100ng/ml）+ IL-2（5u/ml），并以MNCs单独培养作为空白对照组。37，5%CO2及饱和湿度的条件下培养。          形态观察  双相倒置显微镜，每12h观察细胞形态1次。          NKT细胞的含量及表型检测  吸取100l培养的细胞，各加入20l PE标记的TCR V24、CD161及FITC标记的

11、TCR V11单克隆抗体，避光孵育15 min，加入0.5ml PBS，做双荧光检测，测定第7天和第14天TCR V24+ V11+ NKT细胞含量及其他表型特征。        1.3  统计学处理  采用SAS6.0统计软件作配对t检验。        2  结果        2.1  脐血NKT细胞的扩增      &#

12、160;  IL-2刺激单个核细胞中NKT的扩增  扩增后脐血TCR V+ NKT细胞占淋巴细胞的比例：第7天时，UCB-NKT为（0.29±0.09）%；第14天时，为（0.24±0.28）%。与MNCs单独培养组相比，脐血NKT细胞的扩增效率较原来差异无显著性（P0.05）。见表1。          -Galcer和IL-2联合刺激单个核细胞中NKT的扩增  加用-Galcer后，NKT的扩增效率有明显提高，占淋巴细胞的比例：第7天时，UCB-NKT为（24.48±4.19）%；第14天时为（12.15±2.02）%。尤其是培养到第7天的UCB-NKT是原