正交试验优选蜗牛多糖提取工艺的研究

1、正交试验优选蜗牛多糖提取工艺的研究              作者：湛孝东 王克霞 李朝品【摘要】  目的：探讨蜗牛多糖的最佳提取工艺。方法：运用正交试验对浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度4个因素进行优选。结果：蜗牛多糖提取条件的最优组合为：浸提时间6h、浸提温度70、料液比130和乙醇浓度90%。结论：优选的蜗牛多糖提取工艺稳定可行，能有效提高蜗牛多糖得率。 【关键词】  正交试验&#

2、160;蜗牛多糖 提取 优选    多糖是广泛存在于有机体内的一种重要信息分子的受体，它参与分子识别、细胞黏附以及机体防御等过程的调节，使多糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫增强、降血糖、抗凝血和抗衰老等多种生物学活性。此外，多糖大多提取于动植物，是一类毒副作用小的天然药物，因此受到广泛关注。我们发现蜗牛多糖具有抗病毒和增强免疫等活性12。但目前的蜗牛多糖提取工艺存在得率较低的缺点，我们采用正交试验的方法对现有工艺进行了优化，结果报道如下。    1  材料与方法 

3、0;  1.1  试剂和议器  试剂：无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、葡萄糖等，以上试剂均为分析纯。仪器：恒温磁力搅拌器，国华电器；电子天平，瑞士Metller；真空干燥箱，上海一恒；UV1600紫外-可见分光光度计，日本岛津。    1.2  实验方法     1.2.1  正交试验设计  参照预实验及文献资料，选取浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度4个因素，每个因素3个水平，采用L9（3

4、4）正交表，见表1。表1              因素水平表    1.2.2  多糖提取  新鲜活体条华蜗牛（Cathaica fasciola），去壳，清水洗净干燥后精确称取200g，按正交试验设计的因素水平，参考文献方法3，提取蜗牛多糖。    1.2.3  标准曲线绘制及多糖含量测定 &#

5、160;采用苯酚-硫酸比色法，操作步骤如下；精密称取105下干燥至恒重的葡萄糖60mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即为葡萄糖标准液。精密吸取上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml，分别置于50ml容量瓶中，加蒸馏水定容。精密吸取上述溶液各2.0ml，置试管中，然后各管加入5%苯酚1ml，摇匀后迅速加入浓硫酸7ml，5min后置40水浴中加热30min，取出置冰水浴5min。以同样处理的蒸馏水作空白。490nm处测定吸光度A。以A值为纵坐标，以葡萄糖标准液浓度C为横坐标，绘制标准曲线。    根据蜗牛多糖吸光度及标

6、准曲线回归方程计算出蜗牛多糖浓度，并计算得出其含量。    2  结果    2.1  正交试验结果  不同浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度正交试验结果见表2。    2.1.1  直观分析  从表2可以直观看出浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度对蜗牛多糖得率都有影响，主次因素顺序为：ABDC。蜗牛多糖提取条件的最优组合为：A2B2D3C3，即浸提时间6h、浸提温度70、乙醇浓度

7、90%和料液比130。    2.1.2  方差分析  结果见表3。表3    正交试验结果方差分析方差分析的结果表明，浸提时间和浸提温度对多糖的得率有显著性影响（P0.05）。    2.2  标准曲线方程及多糖含量  不同浓度的葡萄糖标准液对应的吸光度A值分别为0.092、0.138、0.233、0.444、0.565和0.702。计算出的葡萄糖标准曲线的回归方程为：A=0.022C0.092

8、，r=0.986。根据葡萄糖标准曲线的回归方程计算出蜗牛多糖含量的平均值为82.1%。    2.3  验证试验  精密称取蜗牛3份，每份200g，以上述蜗牛多糖最佳提取工艺进行提取。测得蜗牛多糖    含量平均值为81.3%，RSD=1.82%，验证结果说明该工艺稳定可行。    3  讨论    在正交设计优选提取条件中，我们得出的最佳乙醇浓度为90%，但是考虑到提取成本的

9、因素，我们实际使用的乙醇终浓度为70%，然后通过反复多次沉淀。这既节约了成本又提高了多糖纯度，效果较理想。    现有文献报道的多糖提取方法大多为植物多糖和菌类多糖，这类多糖的共同特点是成份单一，水溶性较好，因此提取过程较为简单。但蜗牛多糖大部分为蛋白多糖，因此分离较困难，这是蜗牛多糖得率不高的主要原因。此外动物多糖往往还含有脂类，脱脂是否完全直接影响多糖的纯度和得率。本研究参考其他贝类多糖的提取方法，采用甲醇温和脱脂的方法，避免了对多糖结构的破坏，取得了较好效果。    但从实验结果可以看出，同以往文献报道相比4，动物多糖的得率较植物多糖低，可能的因素有两个：一方面动物与植物体内有机物质构成不同，动物的脂肪和蛋白质含量比植物高出许多；另一方面可能是提取方法还不完善。动物多糖特别是贝类多糖的提取工艺还有待深入研究。【参考文献】  1 湛孝东，王克霞，李朝品，等蜗牛多糖的提取和免疫学活性研究J时珍国医国药，2006，17（11）：219121922 王克霞，湛孝东，李朝品，等江西巴蜗牛多糖对乙肝病