毒物分析第四章

1、12022-3-122022-3-1一、一、 origins 起源起源 俄国植物学家茨维特在俄国植物学家茨维特在19061906年使用的装置。年使用的装置。1-1origins and development of chromatography 1-1origins and development of chromatography 色谱法起源与发展色谱法起源与发展Animation动画动画 32022-3-1试样混合物的分离过程也就是试样中各组分试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固

2、定相程。其中的一相固定不动，称为固定相stationary phase；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相（气体或液体），称为流动相mobile phase。42022-3-1 色色 谱谱 法法 柱柱 色色 谱谱 法法 平平 面面 色色 谱谱 法法 毛毛 细细 管管 电电 泳泳 操操 作作 形形分分 配配 谱谱 法法 吸吸 附附 谱谱 法法 离离 子子 交交 换换 色色谱谱空空 间间 排排 阻阻 色色谱谱分分 离离 机机 制制 气气 相相 色色 谱谱 法法 G C 液液 相相 色色 谱谱 法法 LC 相相状状态态 按按流流

3、动动 52022-3-162022-3-172022-3-1名称名称操作形式操作形式柱层析柱层析固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离（正相与反相色谱）固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离（正相与反相色谱）薄层层析薄层层析将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样、流动相展开，使各组份将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样、流动相展开，使各组份分离分离纸层析纸层析用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析薄膜层析将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，

4、以类似纸层析方法进行物质的分离离82022-3-192022-3-1102022-3-1一、一、 process of chromatography 色谱过程色谱过程 该过程主要利用试样中各组分在固定相和流该过程主要利用试样中各组分在固定相和流动相间具有不同的溶解和解析能力；或不同的吸动相间具有不同的溶解和解析能力；或不同的吸附和脱附能力；或其它亲和性能的差异进行分离附和脱附能力；或其它亲和性能的差异进行分离的。的。112022-3-1组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到

5、平衡时过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用）比，称为分配系数，用K 表示，即：表示，即：Ms ccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。分配系数是色谱分离的依据。122022-3-1 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号时间曲线或信号时间曲线或信号流动相体积曲线，称为色

6、谱流出流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。曲线，或色谱图。132022-3-1流出曲线流出曲线（色谱图）（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线：电信号强度随时间变化曲线色谱峰：流出曲线上突起部分色谱峰：流出曲线上突起部分142022-3-1 一、一、 qualitative method色谱定性鉴定方法色谱定性鉴定方法1 1、利用纯物质定性的方法、利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的

7、位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。仪器上获得的数据之间的对比。152022-3-1利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。变化。2 2、利用文献保留值定性、利用文献保留值定性利用相对保留值利用相对保留值r r2121定性定性 相对保留值相对保留值r r2121仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。162022-3-1又称又称KovatsK

8、ovats指数指数()()，是一种重现性较好的定性参数。测定方，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以以100100（如正己烷的保留指数为（如正己烷的保留指数为600600）。）。 其它物质的保留指数（其它物质的保留指数（I IX X）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有分别具有Z Z和和Z Z1 1个碳原子。被测物质个碳原子。被测物质X X的调整保留时间应在相邻两的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：个正构烷烃的调整保

9、留值之间如图所示：172022-3-1182022-3-1一、一、basic priciple 基本原理基本原理纸色谱法是以层析滤纸为载纸色谱法是以层析滤纸为载体的液相色谱法。滤纸中的纤维体的液相色谱法。滤纸中的纤维素通常吸收素通常吸收20%-25%的水分，其的水分，其中约中约6%的水分子通过氢键与纤维的水分子通过氢键与纤维素上的羟基结合，在分离过程中素上的羟基结合，在分离过程中不随有机溶剂流动，形成纸色谱不随有机溶剂流动，形成纸色谱中的固定相。中的固定相。Animation动画动画 192022-3-1纸色谱法是以滤纸作为载体，吸附在纸上的水份作为固定相（纸色谱法是以滤纸作为载体，吸附在纸上

10、的水份作为固定相（有时也可用滤纸吸收其它物质作为固定相），展开剂为不与水相溶的有时也可用滤纸吸收其它物质作为固定相），展开剂为不与水相溶的有机溶剂。在操作方法上类似于薄层色谱法（点样、展开、定位、分有机溶剂。在操作方法上类似于薄层色谱法（点样、展开、定位、分析），其定性参数也为析），其定性参数也为Rf。 202022-3-1由于毛细管作用，展开剂将沿着滤由于毛细管作用，展开剂将沿着滤 纸条上升纸条上升;(2) 展开剂携带试液中的各组分上升，展开剂携带试液中的各组分上升， 并在并在两相间进行反复多次分配；两相间进行反复多次分配；(3) 在流动相中溶解度较小，在固定相中溶在流动相中溶解度较小，在固

11、定相中溶解度较大解度较大 的物质的物质, 将沿着滤纸条向上移动较将沿着滤纸条向上移动较短的距离短的距离, 停留在纸条的较下端。反之，则停留在纸条的较下端。反之，则停留在滤纸条的较上端。试样中的各组份停留在滤纸条的较上端。试样中的各组份得以彼此分离。得以彼此分离。212022-3-1222022-3-1比纸色谱具有速度快、分离清晰、灵敏度高、可以采比纸色谱具有速度快、分离清晰、灵敏度高、可以采用各种方法显色等特点。用各种方法显色等特点。层析装置层析装置232022-3-1242022-3-1252022-3-1262022-3-1展展 开开 溶溶 剂剂原原 点点L0L1L2272022-3-1由

12、来和特点由来和特点 TLCTLC具有样品预处理简单、固定相一次性使用；平面开放型色谱有多路柱效应，具有样品预处理简单、固定相一次性使用；平面开放型色谱有多路柱效应，可同时进行多个样品分析；同一板上不同区域可使用不同显色剂、可同时定性定量。可同时进行多个样品分析；同一板上不同区域可使用不同显色剂、可同时定性定量。因此在实际工作中至今仍然经常应用。但是其主要的缺点是操作费时、精密度和灵因此在实际工作中至今仍然经常应用。但是其主要的缺点是操作费时、精密度和灵敏度较低，限制了应用范围。敏度较低，限制了应用范围。为此，将为此，将HPLCHPLC和和GCGC的技术引进的技术引进TLCTLC。建立高效薄层色

13、谱扫描和。建立高效薄层色谱扫描和TLCTLC不同：不同： 、采用高效固定相；、采用高效固定相； 、利用光谱分析等各种检测手段、利用光谱分析等各种检测手段; ; 、实现计数机和自动化操作。、实现计数机和自动化操作。 在复杂样品、天然产物分析领域得到普遍的应用。在复杂样品、天然产物分析领域得到普遍的应用。282022-3-1仪器系统、薄层制备系统:制板、活化、点样)；、光学系统:光源、双单色器、聚焦系统、反射和透射检测器；、机械系统:完成行扫描或锯齿扫描；、PC仪器控制和数据处理系统:数据处理、绘图、报告打印。292022-3-1302022-3-14，应用 药物分析、 毒物分析等312022-3

14、-1、薄层工作：制板、活化、点样、喷雾显色、紫外照射、目测；、薄层工作：制板、活化、点样、喷雾显色、紫外照射、目测； 、固定斑点扫描：采用单波长扫描，得到吸收光谱、反射光谱或、固定斑点扫描：采用单波长扫描，得到吸收光谱、反射光谱或荧光发射光谱。用对照品对照，用于定性鉴别和寻找定量分析测试条件。荧光发射光谱。用对照品对照，用于定性鉴别和寻找定量分析测试条件。 、斑点双波长直线扫描、斑点双波长直线扫描( (行扫描行扫描) )：双波长测定可消除固定相产生：双波长测定可消除固定相产生的噪音。获得比较光滑的色谱曲线与积分峰面积。通常用对照品采用工的噪音。获得比较光滑的色谱曲线与积分峰面积。通常用对照品采

15、用工作曲线法、内标法或外标法，依据作曲线法、内标法或外标法，依据A-CA-C曲线或曲线或F-CF-C曲线作定量分析。曲线作定量分析。 、斑点双波长锯齿扫描：锯齿扫描可克服行扫描时因斑点形状不、斑点双波长锯齿扫描：锯齿扫描可克服行扫描时因斑点形状不同引起的误差。色谱曲线积分峰面积定量，通常用对照品采用工作曲线同引起的误差。色谱曲线积分峰面积定量，通常用对照品采用工作曲线法、内标或外标法定量分析。法、内标或外标法定量分析。 、常规方法：、常规方法：“双波长双波长”+“+“锯齿扫描锯齿扫描”透射或反射法，可获得透射或反射法，可获得较满意的色谱曲线和良好的线性关系及良好的重现性。较满意的色谱曲线和良好

16、的线性关系及良好的重现性。322022-3-1332022-3-1342022-3-1 气相色谱系流动相为气体的一类色谱仪器分析。常用用H2和N2。有高选择性、高灵敏性、用样量少、分析速度快。适用于组分复杂和具有挥发性的混合物和微量组分，在毒物分析、体内药物分析和兴奋剂检测(GC-MS)等领域广泛应用。 352022-3-1362022-3-1372022-3-1气相色谱流程382022-3-1随着载气的流动，溶解、挥发随着载气的流动，溶解、挥发, ,或吸附、脱附的过程反复地进行。或吸附、脱附的过程反复地进行。Animation动画动画 392022-3-1402022-3-1Animatio

17、n动画动画 412022-3-1Animation动画动画 422022-3-1Animation动画动画 432022-3-1 应用 ，环境污染物、食物添加剂、农药残留量; ，药物组份(如挥发油各种组份)、水分、杂质、溶剂； ，体内药物分析、兴奋剂和毒品。442022-3-1452022-3-1在经典色谱和GC的理论基础上发展形成。在自动化、分离能力、速度及适用范围等方面有飞跃进步。 1，仪器系统：高压输液泵和梯度洗脱系统；进样器(六通进样阀)；检测器(UV、NP、IR、MS)等组成 高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）462022-3-1472022-3-1482022-3-149202

18、2-3-1一、一、Feature of HPLC高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。502022-3-1仪器结构仪器结构, 载气系统, 进样器系统, 柱系统：普通填充柱:F=3-6mm,L=2-4m,F=3-6mm,L=2-4m,毛细管柱:F=0.1- 0.5mm, F=0.1- 0.5mm, L=10-200m, L=10-200m,有空心和填充两类)。, 检测系统 512022-3-11 1、 process 流程流程522022-3-153

19、2022-3-12、main assembly 主要部件主要部件(1) 高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性Animation动画动画 542022-3-1(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯

20、度: 利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。混合后进入色谱柱。内梯度内梯度: 一台高压泵一台高压泵, 通过比通过比例调节阀例调节阀,将两种或多种将两种或多种不同极性的溶剂按一定的不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合比例抽入高压泵中混合552022-3-1(3) 进样装置进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：562022-3-1 3，应用 体内药物分析、中药成分分

21、析、毒物分析，分析血清、血浆、尿、全血、组织等不同试样中的多种类型药物、毒物及代谢产物。 3.1，HPLC-IR联用 测定生物样品的兴 奋剂和毒品572022-3-1582022-3-1 六、质 谱（Mass spectra，MS） 质谱仪是一种将原子、离子或分子转变成带电离子，然后在质量分析器中使其分离，获得按质量顺序排列的图谱，横坐标为离子质量m和电荷e之比(质荷比m/e)，纵坐标为相对丰度(以基峰的离子电流强度作为100)。GC-MS、HPLC-MS广泛应用于毒物分析。 1，仪器结构Animation动画动画 592022-3-1 1.1 离子源 将进样系统引入的样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量差异很大，对不同的将进样系统引入的样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量差异很大，对不同的分子应选择不同电离方法。给样品较大能