低温胁迫所要测的指标

1、低温胁迫所要测的指标一、束缚水和可溶性糖1.1自由水和束缚水测量按照刘向莉等人【1】的称重法来测，将测定糖液的浓度改为直接测定叶片的质量。器材茶叶，称量瓶 3只，天平，蔗糖，纯净水，摇床，湿纱布，滤纸步骤根据上述试验结果 ,归纳称重法的测定步骤如下: 取称量瓶 3只 ,编号。取完整叶片去其主脉 ,剪成几片面积相当的叶片 ,尽量保持叶片完整性 ,不破坏叶片的结构。立即称重后装入称量瓶中。 3个称量瓶加入植物组织质量6倍的 60 % 65 %糖液。各称量瓶置于暗处 6 h,其间不时轻轻摇动。将叶片取出 ,用湿纱布和滤纸吸去表面糖液 ,立即称重。植物组织中自由水含量 (% ) =(浸泡前叶片质量 -

2、浸泡后叶片质量 ) /浸泡前叶片质量 × 100%植物组织中束缚水含量 (% ) =总含水量 -自由水含量1.2电解质渗透率测定按照佘文琴的方法来进行测定【2】。器材茶叶，直径0.6cm打孔器，天平，有盖的三角锥形瓶，无离子水，量筒，恒温箱，DDS-11型电导仪，水浴锅步骤把各叶片置于室温，0和4处理6h后取出,用直径0.6cm打孔器打孔,各处理称叶样3g;重复3次.叶样置于有盖的三角锥形瓶中,加无离子水30ml,静置于20恒温箱中浸提12h,取出用DDS-11型电导仪测定浸提液的电导率。测毕将其放入已沸的水浴锅中煮沸30min;再在20的恒温中静置12h,测定电导率。每处理测10个

3、数据,测定结果按下列公式计算：电解质渗出率 (% ) =(低温处理电导率/煮沸后电导率 ) × 100%1.3可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法【3】：材料、仪器设备以及试剂.1材料茶叶.2仪器设备分光光度计；水浴锅；刻度试管；刻度吸管.3试剂1蒽酮乙酸乙酯试剂取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。2浓硫酸（相对密度1.84）实验步骤1保准曲线的制作（1）1%蔗糖标准液将分析纯蔗糖在80烘至恒质量，精确称取1.000g。加少量水溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。（2）100µ

4、g/L蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度试管11支，从010分别编号，按表加入溶液和水。然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其吸光度，以糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准线方程。表 蒽酮法测可溶性糖标准曲线试剂试剂量管号01、23、45、67、89、10100µg/L蔗糖液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水量/ml2.01.81.61.41.21.0蔗糖量

5、/µg0204060801002可溶性糖的提取取茶树叶片，擦干净表面污物，剪碎混匀，称取0.100.30g共3份。分别放入3支刻度试管中，加入510mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，用蒸馏水反复漂洗试管及残渣并定容至刻度。3显色测定吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复3次），加蒸馏水1.5mL,以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的吸光度，计算可溶性糖的含量。4结果计算由标准曲线方程求出糖的量（µg），按下式计算测试样品的糖含量。可溶性糖含量（%）=(C ×VT×N)/(W×

6、;VS×106) ×100C：从标准曲线查得的糖量（µg）；VT：提取液总体积（mL）；VS：测定时取用的样品提取液体积（mL）；N：稀释倍数；W：样品质量（g）。2茶树叶片的酶活性测定2.1粗酶液的制备取上述待测样品一份，加入3.0mL 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液（内含1%不可溶聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英砂，冰浴下研磨至匀桨。10,000g低温离心15min，取上清液，冰冻保存备用。此粗酶液可用于POD活性、SOD活性、CAT活性、PAL活性的测定。取上述待测样品一份，加入2.0mL 0.05mol/L pH 5.0乙酸钠缓冲液和少许石英砂，冰浴下

7、研磨至匀浆。10,000g低温离心15min，取上清液，冰冻保存备用。此粗酶液可用于-1,3-葡聚糖酶的活性测定。取上述待测样品一份，加入5.0mL 0.1mol/L pH 5.0柠檬酸钠缓冲液和少许石英砂，冰浴下研磨至匀浆。10,000g低温离心15min，取上清液，冰冻保存备用。此粗酶液可用于外切几丁质酶的活性测定。2.2粗酶液的活性测定超氧物歧化酶（SOD）的活力测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法。取3支试管标号，各管均加入反应液3.9mL（加入待测酶液后各试剂终浓度为13mmol/L甲硫氨酸溶液、75mol/L氮蓝四唑溶液、100mol/L EDTA-Na2溶液、4mol/L核黄素溶液

8、）；其中1、2号试管各加入30l待测粗酶液，3号试管只加对应量50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）作为对照，在4000 Lux光照下10 min，黑暗终止反应。以不光照的对照管作为参比管，在560 nm波长处测定各吸光值（A），记录结果。按公式计算出：SOD酶活力 = (Amax - A样品) * V酶液总体积 / (50% * Amax * W(g) * V进样量 * T光照时间)，以抑制NBT光化还原的50%定义为1个酶活性单位（U1）。过氧化物酶（POD）的活力测定采用愈创木酚比色法。取比色杯2只，在一只中加入反应混合液（100 mmol/L pH6.0磷酸缓冲液50mL于烧杯中，加

9、入愈创木酚28l，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19l混合均匀，现用现配，可短期保存于冰箱中）4.0ml，作为校零对照；另一只加入反应混合液3.0mL，再加入蒸馏水980l，再加入待测粗酶液20l，立即开启秒表记录时间，用分光光度计在470nm波长下每隔1min测量吸光值，并计录结果。按公式计算出：POD酶活力 = A470 * V酶液总体积 / (W(g) * V进样量 * T反应时间 * 0.01)，以每分钟内A470变化0.01定义为1个酶活性单位（U2）。过氧化氢酶（CAT）的活力测定采用比色法。将基质液（0.05mol/L pH7.0磷酸缓

10、冲液，含65mo1/L H2O2）于37水浴5min。然后在空白管（B1）分别加入1.0mL基质液、1.0mL 32.4mmol/L钼酸铵和0.3mL待测粗酶液；在空白管（B2）中分别加入1.0mL基质液、1.0mL 32.4mmol/L钼酸铵和0.3mL缓冲液；在空白管（B3）中加1.3mL基质液和1.0mL 32.4mmol/L钼酸铵。在测定样品管（U）中分别加入0.3mL待测粗酶液和1.0mL基质液，37水浴保温1min后立即加入1.0mL 32.4mmol/L钼酸铵，摇匀，10min后在405 nm波长下以水调零比色，记录吸光度值（A）。按公式计算出：CAT酶活力 = (AB1 - A

11、U)/(AB2 - AB3) * 65 * 1 * (V酶液总体积 / V进样量) / W(g)，以每分钟每毫升反应混合液分解1mmolH2O2定义为1个酶活性单位（U3）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活力测定取0.3mL待测粗酶液加入1.0mL 0.02mol/L L-苯丙氨酸，并用蒸馏水补足至4.0ml；对照不加待测粗酶液，直接加4.0ml蒸馏水；反应液置30恒温水浴中保温30min，在290nm波长处测吸光值（A），记录结果。计算出待测样品的PAL活力，以每小时每毫升反应混合液形成1mg肉桂酸（即A290变化0.01）定义为1个酶活性单位（U4）。-1,3-葡聚糖酶的活力测定标准还原糖测定

12、：将500g/mL的葡萄糖溶液准确稀释至150g/mL，把此溶液再稀释成数种不同浓度的溶液。然后取几支干净试管，分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.5mL和0.5mL碱性铜试剂，置沸水溶解10min后，自来水冷却。加入0.5mL砷钼酸试剂，混匀，再加入3.5mL蒸馏水，于分光光度计660nm波长处测定光密度，并作光密度-还原糖浓度标准曲线。在0.4mL柠檬酸磷酸缓冲液（pH5.6，内含1.0 mg/ml昆布多糖）中，加入0.1mL待测粗酶液，37恒温水浴15min。接着加入0.5mL碱性铜试剂，沸水浴10min。冷却后，加入0.5mL砷钼酸试剂，在出现蓝色时加入3.0mL水，摇匀后再稀释10倍。在

13、660nm波长处测光吸收值（A）。在100200×10-3mol/L葡萄糖浓度范围内，还原糖的产生量与酶的活力呈线性关系。以每秒钟内从昆布多糖中释放出1×10-3mol葡萄糖量定义为1个酶活性单位（U5）。外切几丁质酶的活力测定分别吸取各种浓度（0，0.5，1.0，1.5，2.0mg/kg）的N-乙酰葡萄糖胺溶液0.4mL于10mL刻度试管中，加入0.2mL饱和硼砂溶液，沸水中煮7min。冷却后再加入2.0mL冰醋酸和1.0mL l% 对二甲氨基苯醛（DMAB）溶液，37保温15min。冷却后立即在585nm波长处测定其吸光值（A），绘制标准曲线。配制1.2mL反应混合液，

14、其中含0.4mL待测粗酶液，0.4mL醋酸缓冲液（0.1mol/L，pH5.8）和0.4mL胶状几丁质。37下反应2h后，5,000rpm离心6min，终止反应。然后取0.4mL上清液于10mL刻度试管中，按上述测定步骤进行测定上清中的N-乙酰葡糖胺量，以不含酶液的混合液作参比。以每小时分解胶体几丁质产生1 µg N-乙酰葡糖胺定义为1个酶活性单位（U6）。Cu/Zn SOD和 ApxNaCl处理叶圆盘和植株 选取生长七周的植株的第五片到第七叶的叶盘泡在NaC1浓度为0，0.5和1.OmolL的溶液中，然后在25连续光照下照射采样进行样品叶绿素含量的测定。按照Porra等(1989)

15、的方法用1毫升80的丙酮从叶盘中提取叶绿素。体外培养的植株繁殖的高3 cm的茎杆被移栽到含20 ml的基础MS培养基中，直到采样进行发芽率测定，再用80，100 和 120mmolL NaC1处理。酶活性分析叶盘用05molL NaCl处理0 和 60 h后存放在液氮中，泡在适当的均匀缓冲液里。测定SOD 活性的缓冲液是0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液（内含1%不可溶聚乙烯吡咯烷酮EDTA）和少量石英砂，测定APX的是0.05mol/L pH7.0 Hepes（内含ImmoLL抗坏血酸和1 (vv) 活性剂Triton X- 100。分别按照Beauchamp Fridovich(19

16、71)and Mittler Zilinskas (1994)的方法来鉴定SOD酶和APX的活性分析。2.28GPx活力测定.1试剂与仪器1.NaN3-Tris|缓冲液(pH74|) 内含NaN3 5.0mmolL，TrisO.5molL，EDTA25mmolL(04 保存)。2.GSH底物液含NADPH0.2mmolL，GSH12mmolL，GR 6×105UL，当日用NaN3Tris(pH74)缓冲液配制。3.PCOOH底物液自行合成，方法见卫生研究1995年第3期。4.20% Tritonx-100 5.Tris蔗糖组织匀浆液(pH74) 内含蔗糖25molL，Tris 20m

17、molL。6.LKB 4053型动力学分光光度计；蕾国产SDT一1810型组织匀浆器；Beckman L7-65超速离心机.2测定方法1匀浆上清液的制备用预冷的蔗糖-Tris匀浆液1：6稀释，冰浴匀浆后，4 ，1OOO0g离心15min，取匀浆上清液进行PHGPx活力测定。2 PHGPx活力测定方法测定步骤样品 样品管 非酵管匀浆上清液(m1) 0050 一GSH底物液(m1) 0500 050020 Triton× 100(m1) 0015 0015三蒸水(m1) 0385 0|3525放置5min，加入0050ml PCOOH(在反应体系中的终浓度为75umolL)促发反应，立即

18、在340nm波长下(1cm 光径)读光吸收值，反应时间Imin，延迟时间lmin 6杯同时测定。1.叶绿素含量采用丙酮乙醇混合法测定682.SOD用NBT(硝基四氮哇蓝)法测定69 713.POD用愈创木酚氧化法测定704.CAT用KmnO4滴定法715.GSH一Px活性测定用DTNB(5，5一二硫代二硝基苯甲酸)分光光度法726.GSH含量测定用DTNB分光光度法737.MDA用TBA反应法74参考文献：1 刘向莉,高丽红,刘明池,等. 植物组织中自由水和束缚水含量测定方法的改进J. 中国蔬菜, 2005 (4) : 9-112 佘文琴,刘星辉. 荔枝叶片膜透性和束缚水/自由水与耐寒性的关系J.福建农业大学学报,1995,24(1):14-183 王学奎,等.植物生理生化实验原理和技术M.北京:高等教育出版社,2006,5Apx测定GSX测定1. 谷胱甘肽过氧化酶的提取采用 DTNB (5 ,5- 二硫代对二硝基苯甲酸)染色法提取。称取新鲜茶叶叶片材料加入 5倍体积的0.1 mol/ L pH 值为 7.4 的磷酸缓冲液 1 mmol/ L EDTA2Na ,1 %的水溶性 PVP (聚乙烯吡咯烷酮) ,研磨成匀浆 ,在温度 4 下离心 ,取上清液