毕业论文实验步骤(精)

1、5.1.1 实验过程5.1.1.1SM-GA-BSA抗原的制备5.1.1.1.1SM 与 BSA的初始比对偶联效果的影响1、pH9.6 的碳酸盐缓冲液的配制；称取碳酸钠10.2g 及碳酸氢钠 16.8g 溶于双蒸水中定容至6000ml ； 4 冰箱保存备用；2、称取五组 200mgBSA 分别溶于 50mlpH9.6 的碳酸盐缓冲液中，获得A、B、C、D、E 溶液；3、分别称取 50mg、 100mg、 200mg、400mg 、800mg 链霉素，并将其分别溶于50mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中，获得a、 b、 c、 d、e 溶液；4、将 Aa、 Bb、Cc、 Dd、Ee 混合，再分别向五组

2、中缓慢加入0.2mL25%的戊二醛，边加边搅拌。；5、将加入戊二醛后的五组溶液置于室温下搅拌反应6h；6、0.01mol/L 、 pH7.4PBS缓冲液的配制；称取8.0g NaCl、0.1g KCl、 2.9g Na 2HPO4·12H2O 和0.2g KH2PO4,加双蒸水溶解，定容至1000mL， 4 冰箱保存备用；7、反应完后用 pH7.4 的 PBS缓冲液透析 1d；8、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；9、将链霉素， BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；10、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定链霉

3、素与BSA的最佳初始量 x。5.1.1.1.2 戊二醛的量对偶联效果的影响1、称取五组链霉素与 BSA（第一组实验的最佳初始量x）分别溶于碳酸盐缓冲液中，获得 A、B、 C、 D、 E溶液；2、向每组分别缓慢加入0.1mL、0.2mL、0.3mL、 0.4mL、0.5mL25%戊二醛，边加边搅拌，获得 a、 b、 c、 d 、 e溶液，将其置于室温下搅拌反应6h；3、反应完后用pH7.4 的 PBS缓冲液透析1d；4、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；5、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；6、根据紫外扫描

4、结果计算偶联比，确定戊二醛的最佳加入量y。偶联时间对偶联效果的影响1、称取五组一定质量的链霉素、BSA（第一组实验的最佳初始量x），并将其溶于100mL 的碳酸盐缓冲液中；2、分别向五个组中加入一定量的戊二醛（第二组实验的最佳加入量y），边加边搅拌；3、将五个组置于室温下，分别搅拌反应2h、4h、6h 、8h、10h ；4、待每组反应完后，用pH7.4PBS缓冲液透析1d；5、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；6、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；7、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定最佳反应时间t。链霉素

5、 -GA-OVA 包被原的制备其方法与SM-GA-BSA抗原的制备相同。根据以上三组实验，利用正交法分析出链霉素在用戊二醛合成抗原时的最优条件1、根据上述三组实验的x， y， t 对应分别设置三个变量；2、对链霉素与戊二醛的初始比变量进行设置，x-1、 x、 x+1；3、对戊二醛的量进行设置，y-0.1、 y、 y+0.1；4、对偶联时间进行设置， t-2、 t 、t+2 ；5、设计三因素三水平的正交试验；6、对正交实验结果进行方差分析、F 检验，确定出最优偶联条件。5.1.1.4 对不同偶联条件下的偶联液进行SDS-PAGE凝胶电泳：1.各种溶液配制：30%丙烯酰胺：准确称取 29g 丙烯酰

6、胺和 0.8 g 双丙烯酰胺溶于60mL 双蒸水中，于 37溶解，然后补双蒸水至100mL，棕色瓶 4保存浓缩胶缓冲液 (1mol/LTris-HCl， pH6.8)： 6.06gTris 溶解在 40mL 双蒸水中，用4mol/L 盐酸调节 pH 至 6.8，再用双蒸水加至50mL， 4保存分离胶缓冲液 (1.5mol/L Tris-HCl， pH8.8):9.08gTris 溶解在 40mL 双蒸水中，用4mol/L 盐酸调节 pH 至 8.8，再用双蒸水加至50mL， 4保存10%SDS： 25gSDS，用双蒸水溶解至250mL。室温保存10%过硫酸铵 (5ml)： 0.5 g 过硫酸铵

7、溶解于5ml 双蒸水，可在密封的管内，4存放数月 4分离胶缓冲液 (100ml):75ml 1.5mol/l Tris-HCl(pH 8.8),4ml 10% SDS,21ml 蒸馏水 ,可在 4存放数月4堆积胶（浓缩胶） 缓冲液 (100 ml):50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),4ml 10% SDS,46ml 蒸馏水 , 可在 4存放数月电泳缓冲液 (1L):3g Tris 碱 ,14.4g 甘氨酸 ,1g SDS,加蒸馏水至 1L,pH 应该在 8.3 左右，在室温下长期保存5样品缓冲液(10ml):0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),

8、5ml 50%甘油 ,2ml 10% SDS,0.5ml 2-巯基乙醇 ,1ml 1% 溴酚蓝 ,0.9ml 的蒸馏水 ,可在 -20保存数月考马斯亮蓝染色液(1L) ：考马斯亮蓝R-250,1g; 甲醇 ,450ml;蒸馏水 ,450ml; 冰醋酸100mL.脱色 : 脱色液 (1L) ：甲醇 ,100ml; 冰醋酸 ,100ml; 蒸馏水 ,800ml.2. 具体操作步骤：X%分离胶的计算：采用12%的分离胶A 液x/3mlB 液2.5ml蒸馏水（ 7.5- x/3） ml10%过硫酸铵总量灌制分离胶10mlA.将玻璃板洗干净，烘干或者自然风干，装配好灌胶的模具，关键是确保凝胶玻璃板和垫片

9、的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。B.将 A 液、 B 液在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺是神经毒素，操作时必须戴手套。C.加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀，凝胶很快会凝固，所以操作要迅速。D.小心将凝胶液用吸管或移液枪沿隔片缓慢加入模具内，避免在凝胶内产生气泡。E.当加入适量的分离胶溶液时（凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm 或距梳子齿约0.5cm）,轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1 5mm 的水层或异丙醇，这使凝胶表面变得平整。F.等待 30 60min, 使凝胶聚合。 当凝胶聚合后， 在分离胶和水层之间会出现一个清洗的界面。聚合好后微微倾斜模具，用吸管或移液枪将水层

10、或异丙醇层吸出，用吸水纸擦干残留水渍。灌制堆积胶堆积胶经常使用5%的浓度，还是以两块量为例，成分如下：蒸馏水2.3mlA 液0.67mlC 液1ml10%过硫酸铵30ulTEMED5ul按以下步骤操作：A. 将 A 液、 C 液和蒸馏水在三角瓶中混匀B. 加入过硫酸铵和 TEMED,并轻轻搅拌使其混匀C. 将堆积胶加到分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端D. 将梳子插入凝胶内， 直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。 必须确保梳子齿的末端没有气泡。E. 约 30min 凝胶聚合，聚合后小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。F. 将凝胶放入电泳槽中， 将电泳缓冲液加到内外电泳槽中， 使凝胶的上

11、下端均能浸泡在缓冲液中。制备样品和上样将各种样品（纯化前样品、过亲和柱后样品、加热后样品、0h 取样的样品、空载质粒的样品）与 5样品缓冲液在一个Eppendorf 管中混合， 100加热 2 10min 。稍微离心，将样品加到样品孔中。将样品加到加样孔的底部，并伴随着染料水平的升高而升高加样枪头，避免带入气泡。为了避免边缘效应，在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。电泳接通电源，将电压调至 150200V 之间开始电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。结束后从电泳槽中取出玻璃板，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶。采用考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色液：1L考马斯亮蓝 R-2501g甲醇450

12、ml蒸馏水450ml冰醋酸100ml染色过程：将胶置于染色液中， 振荡染色 0.5 1h,有时根据染色液用过的次数多少， 适当延长染色时间。脱色脱色液： 1L甲醇100ml冰醋酸100ml蒸馏水800ml弃去染液，将凝胶在水中漂洗几次，加入脱色液直至背静干净，条带清晰可见。所需药品与器材：链霉素，戊二醛，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸钠，碳酸氢钠，氯化钠，氯化钾，十二水磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，盐酸，蒸馏水，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris，盐酸， SDS，过硫酸铵 ,甘氨酸，甘油，2-巯基乙醇， 1%溴酚蓝，甲醇，冰醋酸，考马斯亮蓝R-250， TEMED烧杯，容量瓶，分光光度扫描仪，透析袋，垂直

13、电泳仪，磁力搅拌器，电子天平，移液管实验五、纯化酶的电泳检测及比酶活测定1、实验目的学会采用 SDS-PAGE(SDS聚-丙烯酰胺凝胶电泳 )分析基因工程产物和蛋白质的纯度鉴定及测定酶的比酶活2、实验原理SDS-PAGE电泳是主要用来测定蛋白质分子量大小及纯度分析的技术。如果在 PAGE系统中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，则蛋白质的迁移率主要取决于其分子量的大小，而与蛋白质所带的电荷和形状无关。SDS是阴离子去污剂，它能与蛋白质的疏水部分结合，并能把大多数的蛋白质分子拆分成亚基形式。由于大多数蛋白质与SDS结合的摩尔比为 1.4： 1，结合量很大，因此，加人 SDS增加了蛋白质表面的负电荷，屏

14、蔽了没有SDS时正常存在的任何一种电荷。 SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化，使得雪茄形状的蛋白质分子的轴比发生改变。 在巯基乙醇的作用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴趋于一致，长轴与分子量成正比。 因此，它们的电泳速度不取决于电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。目前较流行的 SDS-PAGE使用的都是线性垂直薄板状胶，这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。 由于薄片胶可在同一胶上跑很多样品，使聚合、染色脱色具有一致性，所以薄片胶比管状胶的应用更广泛，本实验是按照Bio-rad 的小凝胶系统来设计的，这些步骤也适用于其他系统。经过亲和层析和加热纯化后， 重组木聚

15、糖酶应该在SDS胶片上显示出一个单一的条带， 分子量应该与预期的一样，为40 kDa 左右。同一个酶在相同的测定条件下，如果比酶活越高，则表示该酶的纯度越大，本实验中的木聚糖酶经过了亲和层析和加热两步纯化后，比酶活应该逐渐升高，且经过亲和层析后和加热后的比酶活相差不大。3、实验材料和设备A. 试剂丙烯酰胺（电泳级）双丙烯酰胺（ N,N-甲叉双丙烯酰胺）Tris 碱SDS 十(二烷基磺酸钠，分析纯)TEMED过硫酸铵甘氨酸B. 工作液：A 液: 丙烯酰胺储存液，100ml30% (w/v) 丙烯酰胺， 0.8% (w/v) 双丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒剂，操作时必须戴

16、手套29.2 g 丙烯酰胺0.8 g 双丙烯酰胺加蒸馏水溶至100 ml ，棕色瓶4保存B 液： 4分离胶缓冲液，100ml75ml 2 mol/l Tris-HCl(pH 8.8)4ml 10% SDS21ml 蒸馏水可在 4存放数月C 液： 4堆积胶（浓缩胶）缓冲液，100 ml50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)4ml 10% SDS46ml 蒸馏水可在 4存放数月10%过硫酸铵， 5ml0.5 g 过硫酸铵5ml 蒸馏水可在密封的管内，4存放数月电泳缓冲液： 1L3g Tris 碱14.4g 甘氨酸1g SDS加蒸馏水至1LpH 应该在 8.3 左右，在室温下长期保

17、存5样品缓冲液，10ml0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)5ml 50%甘油2ml 10% SDS0.5ml 2- 巯基乙醇1ml 1% 溴酚蓝0.9ml 的蒸馏水可在 -20保存数月C. 实验设备蛋白质电泳装置（垂直板蛋白电泳仪和电源）电源 (电压 200V，电流 500mA)100沸水浴移液枪摇床1.5 mL 小所料管4、实验步骤待检测的蛋白质分子量的大小决定了所使用的分离胶的浓度，下面为不同浓度的分离胶的分离范围：丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的范围15%15 45kDa12.5%15 60kDa10%18 75kDa7.5%30 120kDa5%60 212k

18、Da制胶所需时间：制分离胶60min制堆积胶30min上样15min电泳45min染色（考马斯亮蓝染色）完全脱色1h8 12hX%分离胶的计算：A 液x/3mlB 液2.5ml蒸馏水（ 7.5- x/3） ml10%过硫酸铵总量10ml灌制分离胶A.将玻璃板洗干净，烘干或者自然风干，装配好灌胶的模具，关键是确保凝胶玻璃板和垫片的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。B.将 A 液、 B 液在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺是神经毒素，操作时必须戴手套。C.加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀，凝胶很快会凝固，所以操作要迅速。D.小心将凝胶液用吸管或移液枪沿隔片缓慢加入模具内，避免在

19、凝胶内产生气泡。E.当加入适量的分离胶溶液时（凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm 或距梳子齿约0.5cm）,轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1 5mm 的水层或异丙醇，这使凝胶表面变得平整。F.等待 30 60min, 使凝胶聚合。 当凝胶聚合后， 在分离胶和水层之间会出现一个清洗的界面。聚合好后微微倾斜模具，用吸管或移液枪将水层或异丙醇层吸出，用吸水纸擦干残留水渍。灌制堆积胶堆积胶经常使用5%的浓度，还是以两块量为例，成分如下：蒸馏水2.3mlA 液0.67mlC 液1ml10%过硫酸铵按以下步骤操作：A. 将 A 液、 C 液和蒸馏水在三角瓶中混匀B. 加入过硫酸铵和 TEMED,并轻轻搅拌使其混匀C. 将堆积胶加到分离胶