RNA干涉与基因沉默研究进展

1、 文章编号 :1672-6197(2004 01-0106-05RNA 干涉与基因沉默研究进展张彬彬(中国海洋大学 生命科学院 , 山东 青岛 266003摘 要 :生物体内导入双链 RNA (dsRNA 后会引起体内同源基因特异的沉默 , 这种现象称为 RNA 干涉 (RNAi . , . 就 RNA 干涉与基因沉默的研究历史 、 .关键词 :双链 RNA (dsRNA ; RNA 干涉 (中图分类号 :Q754:of research on RNA interference and gene silencingZHAN G Bin 2bin(School of Life Science ,

2、 China Sea University ,Qingdao 266003,China Abstract :Introduction of double 2stranded RNA (dsRNA induces specific gene silencing , a phe 2nomenon called RNA interference (RNAi . G ene silencing is an important mechanism for biology expression and regulation , which has important biologic function.

3、Here the study history , mecha 2nism and applications of RNAi and gene silencing are reviewed.K ey w ords :double 2stranded RNA (dsRNA ; RNA interference (RNAi ; gene silencingRNA 干涉 (RNA interference , 简称 RNAi 是目前分子生物学 、 分子遗传学等学科近 10年来研究的 热点之一 . 双链 RNA (dsRNA 介导的遗传干涉机制是 1998年首次在秀丽线虫中发现的 , 它通过 dsRNA

4、 的介导特异性地降解相应序列的 mRNA , 从而导致转录后的基因沉默 (gene silencing 1. RNAi 与锥形 虫 (trypanosomes 、 涡虫 (planarian 、 水螅 (hydra 、 果蝇 (Drosophila 、 斑马鱼 、 青蛙 、 小鼠 、 植物以及真菌 (fungi 等物种中的不同名称的基因沉默现象十分相似 29, 可能在进化的很早期阶段 , 生物就获得了 这种机制 , 它代表了一个古老的细胞反应通路 .1 RNA 干涉的研究历程早在 20世纪 20年代 , 人们就知道 , 如果植物受到野生病毒的感染 , 就能产生对另一种有亲缘关系 的烈性病毒的防

5、御力 . 这可能是最早的 RNAi 现象 . Jonathan G. I (1984 在研究小鼠 L 细胞时就发现反 收稿日期 :2003-10-18作者简介 :张彬彬 (1983- , 女 , 大学生 . 第 18卷 第 1期 山 东 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 Vol. 18No. 12004年 1月 Journal of Shandong University of Technology (Sci &Tech Jan. 2004 义 mRNA 会干扰与之同源的基因表达 (Izant and Weintraub ,1984 , 但是其机制并不清楚 . Jorgen

6、sen (1990 研究牵牛花 (petunia 转导色素合成基因时观察到 , 不仅是转入的基因表达 , 而且自身的色素合成 也减弱了 ,Jorgensen 称这种现象为共抑制 (co 2suppression . Guo Su (1995 证明了 par 21基因的失活会破 坏线虫 (caenorhabclitis elegans 第一次卵裂的不对称性 , 同时发现把 par 21基因的反义 RNA (antisense RAN 注射进线虫性腺的合胞体细胞中后 , 在受注射的亲本及其子一代的体细胞中 , 产生了 par 21基因 功能缺失型或 基因敲除型的表型 . 但令人吃惊的是 , 在她的

7、对照试验中 , 正义 RNA 的单独注入也同样 使 par 21基因的表达受到抑制 . 这与反义 RNA 技术的传统解释机制完全违背 . 华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fire 和马萨诸塞大学医学院的 Craig Mello (1998 首次通过大量尝试证实 10:Guo Su 发现的正 义 RNA 对基因表达的抑制 , 以及过去利用反义 RNA 技术对基因表达的阻断 , 都是由体外转录制备的 RNA (sense or antisense RNA 中污染的微量 dsRNA 所引起的 . 他们将 T4和 T7RNA 聚合酶体外转录 制备的单链 RNA 电泳纯化后再注射给线虫 , 结果只有

8、微弱的基因抑制作用 . 相反 , dsRNA 注射给线虫 , 抑制基因表达的效率比纯化后的单链 2. RNAi. Waterhouse (1998 等人证明在植物中的 RNAi 年时间内陆续发现 RNAi 中 27, 8. 这说明 RNAi 机制很可能是进 RNAi 现象也为再生分子机制的研究开辟了新的途径 . 等人又发现 RNAi 在体外培养的细胞系中也能实现 9. 他们发现对于果蝇 的 S2, 只要在无血清培养基中加入适量 dsRNA , 就可诱导产生 RNAi 效应 . 从而 RNAi 技术为研 究细胞复杂的信号转导途径的生化和分子机制提供了方便 . 剑桥大学的 Zernicka 2G

9、oetz (2002 等人发 现 , 在哺乳动物小鼠的早期胚胎中 dsRNA 也能产生特异性的 RNAi 效应 11. 用 dsRNA 注射小鼠受精 卵和着床前的胚胎 , 发现能够特异性地阻断相应 C 2mos 、 E 2cadherin 和 GFP (绿色荧光蛋白 基因的表达 . 这表明 RNAi 也存在于哺乳动物中 , 同时也为 RNAi 研究人类基因功能和治疗人类疾病提供了希望 . 2 dsRNA 的生化性质2. 1 dsRNA 长度对 RNAi 效应的影响在线虫 、 果蝇中研究表明较长的 (>100bp dsRNA 阻抑效应较强 12 . 在哺乳动物中 , 大于 30bp 的 d

10、sRNA 引起的阻抑效应是广泛的 、 非特异的 , 而不对称性突出 2nt 的约 21nt siRNA 双链复合物可以诱 导特异的沉默效应 13.2. 2 dsRNA 与靶基因的同源性dsRNA 较长时对序列的特异性要求不是非常严格 ,dsRNA 碱基修饰的不同也会影响其抑制作用 . 碱基修饰主要有磷酸化和糖基化两种 . 硫代磷酸化修饰碱基的种类和数量也影响抑制作用 . 单个碱基 A 或 C 或 G 被硫化后影响不大 , 而 U 被硫化后抑制作用下降很多 . 两个碱基硫化后大大减少了抑制作用 , 更多的碱基被硫化时抑制作用基本上就消失了 . 当核甘糖基化 , 如胞嘧啶转换为脱氧胞嘧啶 , 或尿

11、嘧啶 转换为胸腺嘧啶后抑制作用大大降低 . 另外每一种情况下反义链的修饰对抑制的影响更大 14.2. 3 dsRNA 浓度影响抑制作用实验中抑制作用不会随着 dsRNA 浓度的增加而增强 . 可能与 RNA 腺嘌呤核昔酸脱氨酶 (ADARS 的存在有关 14.3 基因沉默基因沉默是指外源基因进入受体有时不能正常表达 , 即使外源基因完整地整合到受体基因组中也701第 1期 张彬彬 :RNA 干涉与基因沉默研究进展 会出现转基因完全不表达的情况 , 这与转基因本身的缺失 、 突变和丢失引起的表达受阻不同 . 可分为两 种类型 , 即转录水平的基因沉默 (transcriptional gene

12、silencing , TGS 和转录后基因沉默 (post 2transcrip 2tional gene silencing ,PTGS , 二者都与基因同源性有关 , 统称为同源依赖型基因沉默 (homology 2depen 2dent gene silencing ,HD GS . TGS 发生于转录的起始和终止 , 是由于 DNA 修饰染色体异染色质化等原 因使基因不能正常转录 , 一般只有外源基因发生沉默 ; 而在 PTGS 中 , 沉默发生在转录后 , 外源基因能够 正常或高速率转录但不进行翻译 , 转录的 mRNA 在细胞质内积累水平很低或根本检测不到 , 通常是外 源基因和

13、内源基因一起沉默 , 在植物 、 动物及真菌上普遍发生 , 分别称为共抑制 、 RNA 介导病毒抗性 (RNA mediated virus resistance ,RMVR 、 RNAi 和压抑作用 .3. 1 转录水平的基因沉默 (TGS 15TGS 可由位置效应引起 , 导入的外源基因整合到宿主基因组时是随机的 , 如果它整合到转录活跃 区 , 如常染色质的解螺旋区 , 转基因就会顺应那个区域的染色质结构 , 进行高水平转录 . , 如果外源 DNA 插入到转录的不活跃区 , 如异染色质区 , . 位置效应 造成的转基因沉默并不需要基因组中有同源序列 . , , , 的启动子结合 , ,

14、 . (RJ GS 与同源拷贝数有 关 , , , 相连的重复序列比不相连的重 , 发生沉默的频率高 . 转基因的串连排列不仅促进 DNA 2DNA 配对 , 也 , 基环 DNA 能够被甲基转移酶特异性识别并甲基化 , 使得基因转录无法 进行 , 反向重复区能够介导从头甲基化模式的高度扩散 .3. 2 转录后基因沉默 (PTGS 3. 2. 1 基因沉默基因通过遗传突变体的筛选方法已鉴定出了生物体中的多种基因沉默的必需基因 . 例如苯哈衣绿藻中 的 mut 26, 拟南芥中 sgs 22、 sgs 23和 met 21等 , 秀丽线虫中的 mut 27、 rds3、 smg 22等 , 果蝇

15、中的 ago2. 研究发 现 16, 这些基因多数属于多基因家族 , 有很大的保守性 , 根据其编码蛋白质的特点可将它们分为 5类 :核酸酶类 mut 27; 核酸解旋酶类 qde 23,sde 23,mut 26等 ; RNA 依赖性的 RNA 聚合酶类 (Rdrp ego 21,qde 21,sde 21,Argonaute 家族成员 (含 PAZ 和 Piwi 结构域 和未知功能的螺旋蛋白 . 进一步研究表明 , 许多基 因沉默必需蛋白与一些基因表达调控因子结构相似 , 如拟南芥的 DDM1蛋白与染色体再构型因子 SWD/SNF2相似 , 由此看来 , 不同生物中的不同基因沉默必需蛋白既

16、有共性又有多样性 .3. 2. 2 基因沉默过程生物体细胞核内的 DNA 反向重复序列 (由于多拷贝基因 、 转座子或基因重组突变等因素 转录产 生 dsRNA , 细胞核内的 dsRNA 被类 Rnase 型酶 (如 Dicer 蛋白 切割成大小约为 21nt 的小分子干扰 RNA (small interference RNA , siRNA , 这些 siRNA 在核内与 CM T 相互作用并引导同源的 DNA 序列 甲基化 , 同时 siRNA 或 dsRNA 直接与同源的 DNA 配对 , 产生 RNA 2DNA 复合物和单链的 DNA 环或产 生 RNA 2DNA 多链结构 , 这

17、些不正常的结构被从头甲基化转移酶识别 , 并使之甲基化 , 产生 TGS 16. 由 不正常单拷贝基因转录出来或特异 mRNA 被切割而成的异常 RNA 作为模板 , 在细胞质 RDRP 作用下 合成 dsRNA , 细胞质中的 dsRNA 也可由病毒 RNA 在病毒 RDRP 作用合成或直接来自细胞核 . 细胞质 dsRNA 在类 RNase 型酶作用下切割成 siRNA , 这些 siRNA 与 Dicer 等蛋白质结合生成 RISC (由 RNA 所形成的沉默复合物 ,RISC 特异性降解同源 mRNA 这一过程也可产生异常 RNA. siRNA 或 dsRNA 可能作为系统基因沉默信号

18、保持基因沉默的特异性 .3. 2. 3 基因沉默产生的几种模型 171 RNA 阈值模型在转基因实验中 , 为了实现外源基因在受体细胞中的高效表达 , 人们往往给外源基因带上强启动 子 , 但事实上却常常导致基因沉默 . 于是 Lindbo 等提出了 RNA 阈值模型 , 认为在细胞质中可能存在801 山 东 理 工 大 学 学 报 2004年 mRNA 的监控系统 , 当某种 mRNA 超量表达以后 , 监控系统就起作用 , 将这种超量表达的 mRNA 降解 . 然而人们随后发现某些不带有启动子的基因转入细胞后同样也能引起 PTGS 现象 , 其作用效果与带有 启动子的序列相近 . Oliv

19、ier Voinnet 等在研究 PTGS 在植物中的传递时发现 , 带有和不带有 35S 启动子 的 GFP (Green fluorescent protein 基因都能引起沉默 , 不带有启动子的 GFP 基因在植物体中不能转录 出 RNA , 却能引起沉默 , 可见沉默并不一定都是外源基因的过量表达 、 转录产物的过量积累造成的 .2 异位配对和异常 RNA 模型该模型认为 PTGS 现象是生物在长期进化过程中形成的对病毒侵染的一种反应 , 与基因的表达产 物是否过量无关 . 当病毒或转入的外源基因内部有同源序列 , 或外源基因与内源基因之间有同源序列 时 , 往往会导致异位配对 (E

20、ctopic paining , 其结果是转录产生异常 RNA (Aberrant RNA ,ARNA , 由于 ARNA 内部的重复序列 , 它可能是双链的 . 另外 , 除异位配对外 ,ARNA 产生的原因还可能是外源基因 中存在异常结构 , 如隐秘的旁侧启动子 (Cryptic flanking promoter 或提前终止末端 (termina 2tion . ARNA 一旦产生并进入细胞质后 , 就会激活依赖于 RNA RNA pended RNA polymerase ,RdRps 的活性 ,RdRps 再以 aRNA (RNA ,CRNA . 这些 CRNA 如果与同源的 , 而

21、后被双链特异 性 RNase 识别 、 降解 . CRNA 结合 , 并被同时降解 . 外 , 这种现象就是植物中的共抑制 . 由于 P GTS 信 , 所以也有人认为 ARNA 一方面激活 RdR ps , 另一 . 然而在有的植物中也发现 ,PTGS 现象不能传递 , Palauqui 和 Balzergue 认 为 ,PTGS 信号能否传递依赖于转入基因的量 . 如果转入基因越大 , 信号就能传递到植物中更多的地方 , 这些信号分子又能启动新的沉默 , 产生新的信号分子 , 于是能使整个植物产生免疫反应 .最近 , 许多实验为这一模型提供了证据 18. Hamilton 等在 4种发生

22、PTGS 现象的植物中分别分离 到了一种 25bp 左右的反义 RNA , 这些 RNA 很可能就是 CRNA , 而且由于 25bp 的大小足以传递一定的 信息 , 又可能通过胞间连丝在细胞之间传递 , 所以认为它很可能是细胞间传递信号的一部分 .另外 , 与 PTGS 有关的蛋白质的发现为异常 RNA 模型提供了部分证据 , 然而 , 也有实验表明如果 将单拷贝的外源基因转入同源基因的单倍体植物中以后 , 也会导致 PTGS 现象 . 这表明 , 同源序列之间 的异位配对 , 也不是导致 PTGS 现象的唯一原因 .3 dsRNA 模型关于 PTGS 的启动 ,Waterhouse (19

23、98 提出了 dsRNA 模型 19. 他们将正义 RNA 和反义 RNA 导入 植物后 , 发现正义 RNA 与反义 RNA 共转录比二者单独作用更容易引起沉默 . 于是他们认为异位配对 并不是导致 PTGS 的根本原因 , 根本原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同 , 这导致正义 RNA 和反义 RNA 的合成 . 这些转录产物将形成 dsRNA ,dsRNA 在细胞质中被螺旋酶 RdRps 和类似于 RNase L 的核酸内切酶形成的复合体所识别 . 螺旋酶使双链解旋 ,RdRps 以其中一条链为模板合成 CR 2NA , 类似于 RNase L 的核酸内切酶结合于 CRNA 的两

24、端 , 当 CRNA 与具有同源序列的 mRNA 结合以 后 ,RNase L 的作用是在单链处切开 mRNA 分子 . 单链 RNA 分子由于没有 5 帽子和 Poly (A 尾巴 , 很快 被其它 RNase 降解 . 这一模型还有待实验进一步证实 18.4 RNAi 生理作用及应用方向4. 1 抑制转座子运动Hiroaki 等用秀丽线虫做表型缺失突变时发现 , 转座子静寂可能是 RNAi 的一种自然功能 , 即 RNAi 可以抑制转座子运动 . K eetting 认为这可能是保护生殖腺细胞以防止转座子积累过多的一种进化机制 .901第 1期 张彬彬 :RNA 干涉与基因沉默研究进展 4

25、. 2 用于病毒的防治水稻黄斑病毒 R YMV 在非洲广泛流行 , 自然的防御机制为隐性 , 多基因性状 , 于是采用转基因沉 默的方法 , 首先将该病毒复制所需要的某种酶的基因转入水稻 , 诱导 PTGS , 从而使植物具有 R YMV 病 毒的抗性 , 这种抗性能稳定遗传 3代 . PTGS 真正用于病毒防治首先要面对的就是其遗传稳定性问题 . 在有性繁殖生物中 , 减数分裂的结果是沉默现象在后代中的遗传很不稳定 , 从 2%100%不等 , 难以控 制 , 但在无性繁殖生物 PTGS 中可保持下去 .4. 3 基因治疗及抗肿瘤策略dsRNA 能够强有力的启动干扰素诱导的抗病毒状态 . 这

26、一过程可能与肿瘤细胞生长停止 、 细胞分 化 、 凋亡诱导 、 癌基因转化以及免疫调节等密切相关 . 正是因为 dsRNA 的这种潜在的临床应用价值 , 医 学家正在探索利用 dsRNA 来治疗肿瘤 、 AIDS 和免疫缺陷等重大疾病 20.参考文献 :1Fire A , Xu S , Montgomery M K , et al. Polent and specific genetic .Na 2ture. 1998,391:8062811.2 Alvarado A S , Newmark P A. Double 22regeneration J.Proc. Natl. A 2cad. Sc

27、i. USA. 19993C interference by double 2stranded RNA in Arabidopsis thalianaJ.Proc. Natl. A 2cad. 25054.4Lobmann J , I , Bosch T C . Silencing of developmental genes in Hydra J.Dev. Biol. 1999,214:2112214.5Ngo H , Tschudi C , Gull K , et al. Double 2stranded RNA induces mRNA degrandation in t rypanas

28、oma brncei J.Proc. Natl. Acad. Sci.6Sharp P A , Zamore P D. RNA interferenceJ.SCIENCE , 2000,287(5462 :243122433.7Wargelius A , Ellingsen S , Fjose A. Double 2stranded RNA induces specific developmental defects in z abraf ish embryosJ.Biochem Bio 2phys Res. Commun , 1999,263:1562161.8Tchurikov N A ,

29、 Chistyakova L A , Zarilgelsky G B , et al. G ene specific silencing by expression of paraued cemplementary RNA in Es 2cherichia coli J.The Journal of Biological Chemistry , 2000,276(34 :26532226529.9Clemena J C , Worby C A , Simonson 2Lea N , et al. Use of double 2stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transu 2dation path Ways J.Proc. Natl Acad Sci. USA , 2000,97(2 :649926503.10Guo S , Kemphues K J. Par 21,a gene required for establishing polarity