连接及转化（课堂PPT）

1、.1实验四实验四:目的目的基因的连接、转化的连接、转化.2实验目的及背景 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体，隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方并确定重组方案后，下面要进行的就是片段之间的体外案后，下面要进行的就是片段之间的体外连接，从而获得重组子。连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生的生产），还可用于序列分析和转基

2、因等重要生物技术的研究中。物技术的研究中。.3.4 目的基因浓度测定 线性化载体和目的基因体外重组 感受态大肠杆菌的制备 重组子的转化 转化大肠杆菌的培养本次课程的实验内容：.5质粒载体特点质粒载体特点 1. 至少有一个复制起点，至少有一个复制起点，因而至少可在一种生因而至少可在一种生物体中自主复制。物体中自主复制。 2. 至少应有一个克隆位至少应有一个克隆位点，以供外源点，以供外源DNA插插入。入。 3. 至少应有一个遗传标至少应有一个遗传标记基因，以指示载体记基因，以指示载体或重组或重组DNA分子是否分子是否进入宿主细胞进入宿主细胞质粒载体质粒载体.6.72.分子的体外重组分子的体外重组

3、分子的体外连接就是在一定条件下， 由连接酶催化两个双链片段相邻的端磷酸与端羟基之间形成磷酸二酯键的生物化学过程.8常用的DNA连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的DNA连接酶 (2)来自噬菌体的T4 DNA连接酶。连接酶.9DNADNA连接示意图连接示意图.101. 1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为为8 8：1 1到到1 1：1616，但通常的变化范围是，但通常的变化范围是3 3：1 1到到1 1：3 3。插入片段的长度。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要和序

4、列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用积中，通常一个连接反应用10-50ng10-50ng的载体的载体DNADNA。2. 2. 进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连接在接在2222保温保温4-164-16小时，粘性末端在小时，粘性末端在2222保温保温3 3小时，或小时，或1616保温保温1616小时。大多数连接反应用小时。大多数连接反应用T4DNAT

5、4DNA连接酶，但大肠杆菌的连接酶，但大肠杆菌的DNADNA连接酶可用连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 3. 载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是不是TETE，毕竟，毕竟TETE中含有离子，可能影响连接反应。中含有离子，可能影响连接反应。连接反应中值得注意的几个问题：连接反应中值得注意的几个问题：.11碱性磷酸酶处理质粒载体碱性磷酸酶处理质粒载体 为了提高连接效率，一般采取提高的浓度，增加重组子比例。这样就会出现自生连接问题，

6、为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。.12载体自连及去磷酸化示意图载体自连及去磷酸化示意图.13常用碱性磷酸酶常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIAP(小牛肠)分子量 80,000温度 60 65最适PH8.0热稳定性好，100 暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量 100,000温度 37 最适PH10.0附近（高底物浓度）PH 8.0附近（低底物浓度）6530分钟处理99的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理.14.15本实验连接材料及连接体系本实验连接材料及连接体系.16.1

7、7连接体系连接体系载体DNA 50 ng 0.5ul目的DNA 19 ng ? ul双蒸水 ? ul 5ul连接反应液（2） 5ul总体积 10ul用加样器柔和吹打混匀,16连接2小时。附注：载体和目的基因的摩尔比为附注：载体和目的基因的摩尔比为1:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng.182的转化 感受态细胞的制备 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。.19.20.21.2250-100mmol/LCaCl2 .23CaCl2法制备感受态细胞流程法制备感受态细胞流程将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，3737培养培养16

8、162020小时。小时。挑取单菌落转入挑取单菌落转入10ml LB10ml LB培养基中，培养基中，37 37 振荡培养过夜。振荡培养过夜。从中吸取从中吸取1ml1ml转入转入50ml LB50ml LB培养基中培养基中3737振荡培养，振荡培养， 测测ODOD600600达达0.40.40.60.6。培养物在冰浴中放置培养物在冰浴中放置1010分钟。分钟。取取1.5ml1.5ml加入预冷的加入预冷的EppendorfEppendorf管中，于管中，于5000rpm5000rpm下室温离心下室温离心2-52-5分分钟。钟。弃上清，加入弃上清，加入1ml1ml用冰预冷的用冰预冷的0.1M 0.1

9、M CaClCaCl2 2 ，混匀，置冰上，混匀，置冰上1010分钟。分钟。5000rpm 45000rpm 4离心离心5 5分钟，弃上清，加分钟，弃上清，加100ul 0.1M 100ul 0.1M CaClCaCl2 2重悬，置冰重悬，置冰浴备用或于浴备用或于44短期保存。短期保存。若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有1515甘油的甘油的0.1M 0.1M CaClCaCl2 2 中，放入中，放入-80-80冰箱或液氮中冻存。冰箱或液氮中冻存。.24转化转化 取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；取制备好的感受态细胞，置于

10、冰浴上； 向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的1/101/10体积），柔和混匀后冰浴上放置体积），柔和混匀后冰浴上放置30min30min； 将连接体系放入将连接体系放入4242水浴中热激水浴中热激90sec90sec；迅速转入；迅速转入冰浴冰浴2min2min； 加入加入0.8ml LB0.8ml LB培养基，培养基，3737振荡培养振荡培养45min45min； 取适量培养物涂布于取适量培养物涂布于Amp+ LBAmp+ LB固体培养基，放入固体培养基，放入3737培养箱中培养。培养箱中培养。.25转化示意图转化示意图.261. 0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2. 加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成羟基-磷酸钙复合物，