中国林蛙皮抗菌肽的提取及其抗菌活性的研究

1、中国林蛙皮抗菌肽的提取及其抗菌活性的研究王战勇1，井静1，苏婷婷2(1. 辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁抚顺 113001；2. 辽宁石油化工大学化学与材料学院，辽宁抚顺 113001)摘要: 采用甲醇提取中国林蛙皮肤中的抗菌肽。并考察了影响抗菌肽粗提物抑菌率的各个因素：如提取时间、提取温度、料液比和pH值等因素，通过正交试验确定了获取抗菌肽粗提物的最佳条件。即：提取时间为24h，提取温度为-20，提取料液比为1：25，提取液pH值5.0。此条件下抗菌肽粗提物抑菌率可达75.22%。抗菌肽粗提物对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌以及真菌均有一定抑制效果。对各测试菌株的最低抑制浓度分别为：金

2、黄色葡萄球菌和链球菌为0.25mg/mL；枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为0.5mg/mL；蜡样芽胞杆菌为1.0mg/mL；白色念珠菌、酿酒酵母和毛霉为2.0mg/mL；根霉为4.0mg/mL。关键词：中国林蛙；抗菌肽；正交试验；抑菌活性中图分类号：Q516 文献标识码: AThe Study on Extraction and Antimicrobial Activity of Antimicrobial Peptides from Skin of Rana chensinensisWANG Zhanyong1, JING Jing1, SU Tingting2(1. School of Envir

3、onmental and Biological Engineering, Liaoning Shihua University, Fushun 113001, China；2. School of Chimical and Material Sciences, Liaoning Shihua University, Fushun 113001, China)Abstract: Antimicrobial peptides were isolated from Skin of Rana chensinensis by methanol. Some factor of influence on a

4、ntimicrobial percentage of antimicrobial peptides crude product was reviewed, such as time, temperature, ratio of sample and extraction solvent and pH. The optimum condition was chosen by orthogonal experiment. The optimum conditions are as follows: The ratio of sample and extraction solvent is 1: 2

5、5. The extracting solution was disposed for 24h at -20. And the pH of extracting solution is 5.0. Under the optimize conditions antimicrobial percentage of antimicrobial peptides can reach 75.22%. Antimicrobial peptides crude product could effectively inhibit the growth of series microorganisms, inc

6、luding Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungus. The MICs of the tested microorganisms were tested as follows: The MIC of Staphylococcus aureus and Streptococcus is 0.25mg/mL, the MIC of Bacillus subtilis and Escherichia coli is 0.5mg/mL, the MIC of Bacillus cereus is 1.0mg/mL, the

7、MIC of Candida albicans, Saccharomyces cerevisia and Mucor is 2.0mg/mL, the MIC of Rhizopu is 4.0mg/mL.Key words: Rana chensinensis, Antimicrobial Peptides Orthogonal experiment, Antimicrobial Activity 两栖动物皮肤在自然进化过程中形成了防御病原微生物的三套防御系统，相应地具有与这些防御系统相适应的特定结构。皮肤抗菌肽是其中先天防御系统的主要组成部分。两栖动物皮肤抗菌肽具有高效、广谱、不易产生耐药

8、性等特点1,2。这使其在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天有望成为新一代的临床抗菌药物3, 4 ,并成为当前的研究热点。中国林蛙(Rana chensinensis)是我国传统的名贵药用动物，俗称哈士蟆，其应用部分主要是雌性个体的输卵管。东北地区年产林蛙10亿余只，大量的蛙皮尚未被有效的开发应用。林蛙皮肤湿润、裸露，为抵御环境有害因子侵袭，在自然选择的过程中，经长期进化，其皮肤分泌液中含有大量具有防御功能的抗菌活性物质56。本研究在大量实验的基础上进一步优化了林蛙皮抗菌肽的提取条件，并进行体外抗菌作用研究，通过对一些具有代表性的菌株进行考察，以了解其抗菌谱范围及抗菌强度，为进一步探讨其抗菌作用机理

9、，将其开发为低毒、高效药用资源或食物保鲜剂提供实验依据。1 材料与方法1.1 材料与仪器 实验材料作者简介：王战勇（1978.4），男，辽宁抚顺，讲师，在读博士，主要从事微生物学及生物化学研究。取林蛙油后的中国林蛙干品由抚顺市东星林蛙精品研究所提供。从提取取林蛙油后的中国林蛙上剥取蛙皮，尽量除去肌肉等杂质，用剪刀将林蛙干皮剪碎，蒸馏水清洗，自然干燥，备用。 实验菌种金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 、枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 、蜡样芽胞杆菌( Bacillus cereus)、大肠杆菌(Escherichia coli) 、链球菌(St

10、reptococcus)、白色念珠菌（Candida albicans）酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 、根霉( Rhizopus) 、毛霉( Mucor) 。以上菌种均为本实验室保藏菌种。1.2 实验方法 样品制备将预处理的样品使用甲醇于一定温度浸提一段时间。取浸提液进行减压蒸馏，再经冷冻干燥，得到抗菌肽粗提物。以大肠杆菌为受试菌，接种于LB液体培养基中，37 恒温培养24h。将粗提物用1ml 蒸馏水溶解，取100l，加30l LB 培养基和70l菌液(菌液浓度为5 × 103CFU/ml)并混匀，37、150r/min摇床孵育1h，取100l 涂布

11、于LB平板，37培养过夜，计菌落数。以蒸馏水为对照组。计算抑菌率。实验重复3次，计算平均值。1.2.2 抗菌肽粗提物的抑菌效果将所有供测试的菌种移接入相对应的培养基（细菌和酵母菌使用LB培养基；真菌使用PDA培养基7）上，细菌置于37 恒温培养箱内培养24 h，霉菌、酵母菌于28 培养48 h。用接种环挑取菌体或孢子置于50 ml无菌生理盐水中，混匀制成菌体悬液或孢子悬液。采用杯碟法测定抑菌效果，菌体悬液或孢子悬液均匀涂布于相应的平板培养基, 将牛津杯放置平皿菌层上，每杯加入0.2 ml浓度为0.5mg/ml的抗菌肽溶液，于恒温培养箱中培养( 细菌37 ，24 h；霉菌、酵母菌28，48 h)

12、 ,观察培养结果，测定平皿内抑菌圈直径大小，实验重复3次，计算平均值。抗菌肽最小抑菌浓度( MIC) 的测定8：将样品配制成一系列浓度梯度的溶液。向对应固体培养基平板中分别移取不同浓度的稀释液各1.0 mL，再分别移取各菌悬液0.2 mL，均匀涂布后, 在适宜温度下培养，以不长菌的最低浓度为最小抑菌浓度。2 结果与讨论2.1 抗菌肽粗提物最适提取条件的确定2.1.1 提取时间对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与甲醇按料液比120混匀，室温（25），pH为6.0的条件下提取不同时间，取上清液减压蒸馏，真空干燥，得抗菌肽粗提物，测定其抑菌率。结果如图1所示。图1提取时间对抗菌肽粗提物抑菌率的影

13、响Fig.1 Effect of extracting time on antimicrobial percentage of antimicrobial peptides crude product由图1可知，提取时间对抗菌肽粗提物抑菌率有一定的影响。提取时间小于24h时，随着提取时间的延长，产物得率显著增加。24h以后继续增加提取时间，抑菌率提高幅度不大。因此要在提取时间24h以上才能有较好的提取效果。2.1.2 提取温度对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与甲醇按料液比120混匀， pH为6.0，提取时间24h的条件下于不同温度提取，上清液减压蒸馏，真空干燥，得抗菌肽粗提物，测定其抑菌

14、率。结果如图2所示。图2 提取温度对抗菌肽粗提物抑菌率的影响Fig.2 Effect of temperature on antimicrobial percentage of antimicrobial peptides crude product为最大限度保持抗菌肽活性，提取温度不宜过高，本实验只选取-20，4，室温（25）三个条件考察。由图2 可知，随着提取温度的升高, 提取物的抑菌率逐渐下降，而提取温度在-20时能最大限度保持提取物活性，提取物有较高的抑菌率。 料液比对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与甲醇按不同料液比混匀后，-20，pH为6.0的条件下提取24h，上清液减压蒸馏，

15、真空干燥，得抗菌肽粗提物，测定其抑菌率。结果如图3所示。图3料液比对抗菌肽粗提物抑菌率的影响Fig.3 Effect of sample and liquid ratio on antimicrobial percentage of antimicrobial peptides crude product由图3可知，随着料液比的增大，抗菌肽粗提物抑菌率呈现先升高后下降的趋势。在料液比为1：251：30时，提取物有较高的抑菌效率。2.1.4 pH对抗菌肽粗提物抑菌率的影响将预处理样品与调节为不同pH值的甲醇按料液比1：25混匀后，-20的条件下提取24h，上清液减压蒸馏，真空干燥，得抗菌肽粗提物

16、，测定其抑菌率。结果如图4所示。图4 pH对抗菌肽粗提物抑菌率的影响Fig.4 Effect of pH on antimicrobial percentage of antimicrobial peptides crude product由图4可知，提取剂的pH对提取物的抑菌率有较大的影响，随着pH的增大，抗菌肽粗提物抑菌率呈现先升高后下降的趋势。在pH为5.0时，提取物有较高的抑菌效率。 正交试验根据影响提取物的各个单因素的考察，设计一个L9（34）正交试验，实验方案如表1所示。实验结果如表2、表3所示。表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of o

17、rthogonal experiment水平实验因素A提取时间（h）B提取温度()C料液比DpH118-201：204.522441：255.0336251：305.5表2 正交试验直观分析Table 2 The intuitionistic analysis of orthogonal experiment实验号实验因素抑菌率（%）ABCD1111155.212122269.343133340.224212373.375223165.296231257.327313255.398321347.219332158.35均值154.92361.32353.24759.617均值265.32760

18、.61367.02060.683均值353.65051.96353.63353.600极差R11.6779.36013.7737.083表3 正交实验方差分析表Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment方差来源偏差平方和自由度方差F(=0.05)A246.19521.1384.460B162.93620.753C369.05721.705D87.51220.404误差865.708根据表2和表3，发现因素C即料液比为显著影响因子。获得最高抑菌效率的抗菌肽提取物的提取条件为A2B1C2D2,即：提取时间24h，提取温度为-20，提

19、取料液比为1:25，提取液pH为5.0。此条件下抗菌肽粗提物的抑菌率可达75.22%。2.2 抑菌实验 抗菌肽粗提物的抑菌活性抗菌肽粗提物对不同微生物的抑菌效果见表4。表4 抗菌肽粗提物对不同菌种的抑菌直径Table 4 Antimicrobial diameter of different microorganisms for antimicrobial peptides crude product测试菌种抑菌圈直径（mm）D1D2D3D均值金黄色葡萄球菌18131515.3枯草芽胞杆菌15111212.7蜡样芽胞杆菌15131213.3大肠杆菌1011910.0链球菌21182019.7白

20、色念珠菌118109.7酿酒酵母9111010.0根霉9111210.7毛霉101089.3由表4可知，林蛙皮抗菌肽粗提物对所测试的各种革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌均有一定得抑制效果，对于金黄色葡萄球菌和链球菌的抑菌效果最为显著。对受试的G+细菌有较强抑制作用，对受试G-细菌的抑制作用相对较弱，对真菌的抑制效果相对最弱。 抗菌肽粗提物最小抑菌浓度( MIC) 的测定抗菌肽粗提物最小抑菌浓度( MIC) 的测定结果具体见表5。表5 抗菌肽粗提物最小抑菌浓度( MIC) 的测定Table 5 The minimal inhibitory concentration (MIC) of antimic

21、robial peptides crude product测试菌种抗菌肽粗提物浓度（mg /mL）4.02.01.00.50.250.10金黄色葡萄球菌-+枯草芽胞杆菌-+蜡样芽胞杆菌-+大肠杆菌-+链球菌-+白色念珠菌-+酿酒酵母-+根霉-+毛霉-+注：“-”表示无菌生长；“+”表示有少量菌落生长；“+”表示有不超过1/ 3平皿面积的菌落生长；“+”表示有不超过1/ 2 平皿面积的菌落生长；“+”表示有超过1/ 2 平皿面积的菌落生长。由表5可知，对各供试菌株的最低抑制浓度：金黄色葡萄球菌和链球菌为0.25mg/mL；枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为0.5mg/mL；蜡样芽胞杆菌为1.0mg/mL；白色念珠菌、酿酒酵母和毛霉为2.0mg/mL；根霉为4.0mg/mL。3 结论林蛙皮抗菌肽的甲醇提取方法工艺简单，成本较低，产物抑菌效果较高，提取工艺为：提取时间24h，提取温度为-20，提取料液比为1:25，提取液pH为5.0。林蛙皮抗菌肽粗提物对各种革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌均有一定得抑制效果，因此在食品防腐和医药领域具有一定的开发前景。参考文献1 Mohamed F A, Soto A, Knoop F C, et al. Antimicrobial peptides isolated from skin secretions of the dipl