补肾益气中药对小鼠围着床期子宫内膜形态结构及PR表达的影响

1、补肾益气中药对小鼠围着床期子宫内膜形态结构及PR表达的影响         08-10-21 13:21:00     编辑：studa20              作者：刘艳娟 黄光英 杨明炜 陆付耳 【摘要】  目的探讨补肾益气中药改善胚泡着床障碍小鼠着床期子宫内膜微环境的机制。方法于妊娠第4天9AM利用米非司酮建立胚泡着床障碍小鼠

2、模型，予补肾益气中药进行干预，于妊娠第4天9PM处死小鼠，观察子宫内膜形态学变化，采用免疫组化技术及Western blot技术检测子宫PR的表达。结果与正常组相比，模型组子宫内膜发育不良，中药组子宫内膜的发育与正常组相似；中药组子宫内膜腺体、间质、腔上皮细胞PR表达范围和强度及PR蛋白的表达均较模型组显著增高，子宫PR蛋白的表达较模型组显著增高，与正常组无显著差异；结论补肾益气中药通过改善子宫内膜发育,调节胚泡着床障碍小鼠子宫组织PR蛋白的表达，改善子宫内膜着床微环境，利于胚泡着床。 【关键词】  补肾益气中药；子宫内膜着床微环境；孕激素受体Abstract: Objective

3、To explore effect of Bushen Yiqi Recipe（BSR）on endometrial microenvironment in embryo implantation dysfunction mice(EID). Methods Mice model of EID induced by mifepristone at 9AM on day 4 of pregnancy (Pd4) were intervened with BSR, and sacrificed at 9PM on Pd4. The structure of endometrium was obse

4、rved by lightmicroscope. The endometrial PR expressions were assessed by immunnohistochemical SP method and western blot. Results Endometrial morphology showed endometrial development retardation in model group ，while endometrial development in treatment group was significantly improved and nearly s

5、imilar to control group. Levels of PR in the BSR treated group were significantly higher than those in the model group respectively, and showed insignificant differences from those in the normal control group. Conclusion BSR could improve the embryo implantation by way of regulating development of e

6、ndometrium and the levels of PR expression in mice with EID.Key words： Bushen Yiqi Recipe; endometrial implantation microenvironment; progesterone receptor   不孕症的发生率约占育龄妇女的15%，尽管人工助孕技术（IVFET）治疗不孕症已获得较大的成功，但其妊娠率仍较低。胚泡着床障碍是导致IVFET临床妊娠率低的主要原因之一，子宫内膜着床微环境是影响胚泡着床的主要原因之一1。因此，改善子宫内膜着床微环境，提高着

7、床率是提高人工助孕技术孕育成功率的关键。    补肾益气中药由桑寄生、黄芪、丹参等药组成，具有补肝肾、益气血之功效。前期研究已观察到，在妊娠早期，补肾益气中药能提高胚泡着床障碍小鼠的胚泡着床率2。其配合IVFET治疗不孕症，可提高胚泡移植的成功率3。为探讨补肾益气中药促进胚泡着床的作用机制，本实验拟通过观察补肾益气中药对胚泡着床障碍小鼠围着床期，子宫内膜形态结构、子宫孕激素受体（progesterone receptor，PR）的表达，进一步阐述补肾益气中药对围着床期子宫内膜着床微环境的影响。1  材料与方法1.1  实验动物 清洁级

8、性成熟期、雌性未孕昆明小鼠，体重3035g，雄性小鼠40g左右，由湖北省卫生防疫站实验动物中心提供，合格证号：医动字第19-082号。1.2  实验药物及试剂 补肾益气中药由同济医院中西医结合研究所中药制剂室提供，由桑寄生、黄芪、丹参等组成，采用水煎醇沉工艺制成144%无菌煎济，分装于无菌小瓶中，-20冰箱保存。将米非司酮片剂（北京第三制药厂生产）研碎，溶解于丙二醇（国产分析纯）中，配制成0.8mg/ml浓度。SP免疫组化试剂盒、ECL试剂盒为MBI公司产品；PR多克隆抗体为Santa Cruze 公司产品。1.3  动物分组及处理 将雌(32±

9、;4g)、雄(40±4g)小鼠分笼适应性饲养3d后，于每日以雌雄2:1的比例合笼，次日8:00检查雌鼠阴道，发现阴栓计为妊娠第1天（pd1）。将孕鼠随机分为正常组、模型组和中药组，每组各6只。于妊娠第4天（Pd4）9：00皮下注射米非司酮0.03mg/kg体重建立胚泡着床障碍模型，正常组皮下注射等量丙二醇溶剂。于妊娠第4天21:00，颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖腹，取出子宫，用于光镜检测、免疫组化及Western blot分析。1.4  光镜观察小鼠子宫内膜形态结构 子宫标本用100ml/L福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，制作组织切片，光镜观察子宫内膜腺上皮细

10、胞、间质细胞的变化；选用同批染色切片，每张切片在光镜下（×40）随机取5个不同的视野，以每张切片染色的背景作对照，经HPIAS1000病理图文分析系统（同济医学院千屏音像公司）分析，分别测定并计算子宫内膜腺体面积、腺腔面积、腺上皮细胞面积及宫腔上皮厚度。1.5  小鼠子宫PR免疫组化分析 将子宫标本制作石蜡切片，采用过氧化物酶标记的链霉卵白素免疫组化法（SP法）染色，检测子宫内膜PR的表达。按照试剂提供的实验步骤进行操作。免疫组化分析结果判断：PR的阳性表达为细胞质呈棕黄色，主要位于子宫内膜腺体、间质细胞内。选用同批染色切片，每张切片在光镜下（×40）随机取5个不同的视野，以每张切片染色的背景作对照，经HPIAS1000病理图文分析系统分析，分别测定并计算子宫内膜腺体、间质、腔上皮细胞的阳性信号所占的各自面积比和平均光度，表示阳性信号的表达范围和表达强度。以PBS代替抗做阴性对照。1.6  小鼠子