细菌鞭毛染色及运动性观察

1、细菌鞭毛染色及活菌运动性观察【摘要】本实验以铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌为实验菌种，先使用压滴法制片，之后用光学显微镜的油镜观察细菌的活体运动。然后，使用鞭毛染色法（用硝酸银染液A液和B液进行染色）对其染色，之后用光学显微镜的油镜观察细菌鞭毛的形态；虽然最后并没有在显微镜下观察到染色后的鞭毛，但在实验中已大致掌握相关实验操作。【关键词】铜绿假单胞菌；枯草芽孢杆菌；鞭毛染色法；压滴法【前言】鞭毛是生长在某些细菌体表的长丝状，波曲型的蛋白质附属物，具有运动功能。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为1020nm，只有用电子显微镜才能观察到。但可以使用鞭毛染色法，使之能用普通

2、光学显微镜观察到。因此在本实验中，要观察细菌鞭毛形态，就要使用鞭毛染色法。本实验使用染液的是硝酸银染液A液和B液。而观察细菌的运动性时要使用压滴法。本实验选用的的菌种是具周生鞭毛的枯草芽孢杆菌和具端生鞭毛的的铜绿假单胞菌，均可使用两种方法进行观察。本实验报告先介绍了本次实验的实验材料与方法，然后是对实验的结果与分析进行描述，最后是总结性的小结部分。1.实验目的1.1学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征1.2巩固显微镜操作技术及无菌操作技术1.3学习压滴法观察细菌运动性（活细胞）2 实验原理21细菌鞭毛染色法的基本原理简单染色法适用于一般的微生物菌体的染色，而某些微生物具有一些特殊结构，如鞭

3、毛，对它们进行观察之前需要进行有针对性的染色。鞭毛是细菌的纤细丝状的运动器。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为1030nm，只有用电镜才可以直接观察到。若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。首先用媒染剂处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）进行染色。2.2菌种压滴法观察活菌运动的基本原理鞭毛的功能相当于船的螺浆，在水中可以高速旋转从而推动菌体前行，因此水体环境才是鞭毛细菌自由驰骋的天地。鞭毛的旋转速度是非常快的，每秒钟旋转两百到一

4、千多转，比一般的电动机要快得多。鞭毛的高速旋转是由其附着于菌体上的基体旋转带动的，基体实际上就是鞭毛的基部，它由一个中轴套上两个或四个环构成，镶嵌固定在细菌的体表（细胞膜和细胞壁）中，在科学家的眼中，基体简直就是一台精巧的纳米机械分子马达，但这个马达并不是靠电流驱动，而是用伴随着细胞膜两侧质子梯度的消失产生的生物能量ATP来驱动，鞭毛马达还可以转向（从反时针旋转变为顺时针旋转）从而使菌体发生翻滚进而改变细菌的运动方向，事实上细菌在游动时也并不是单纯地一直朝前游，而是伴随着不时的随机翻滚转向，但从表观上看仍表现为细菌的前行。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行

5、观察。有鞭毛的细菌运动活泼，且不同时向一个方向运动，而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。这样便可以在光学显微镜下观察到细菌的运动。3材料与方法3.1 材料枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌。硝酸银鞭毛染液（A、B液），蒸馏水，95%的乙醇。普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，盖玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），接种环，试管架，镊子，吸水纸，滴管等。3.2 步骤和方法先在载玻片上滴一滴蒸馏水，无菌操作用接种环由枯草芽孢杆菌（或铜绿假单胞菌）1418h牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上挑去适量菌落边缘菌体在水中轻轻蘸几下，注意保持其不受猛烈震荡。再另取一洁净盖玻片让其一端紧靠液滴，再缓慢放下，避免产生气泡。

6、使用光学显微镜中的油镜进行镜检，观察到两个或以上的细菌分别朝着相反或不同的方向运动时则说明细菌自身在运动。洗片95%乙醇浸泡5分钟涂片自然干燥A液染色35min水洗B液冲覆盖30s1min（稍加热）水洗自然干燥镜检先用去污粉洗净载玻片约8片（每人两片），再在培养皿中倒入适量的95%的乙醇溶液，将洗净的载玻片放入浸泡5分钟。然后取出在酒精灯外焰灼烧，使其上的酒精挥发掉。在载玻片上滴一滴蒸馏水，无菌操作用接种环由枯草芽孢杆菌（或铜绿假单胞菌）1418h牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上挑去适量菌落边缘菌体在水中轻轻蘸一蘸，注意保持其不受猛烈震荡。倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端，用吸水纸吸去多余菌悬液，

7、自然干燥。滴加硝酸银染液A液覆盖菌面35min后用蒸馏水沿载玻片背面冲洗，充分洗去A液。用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面数秒至1min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。使用光学显微镜中的油镜镜检：将做好的涂片放到显微镜下，由多到少观察两种菌，以方便找到鞭毛（注：枯草杆菌的菌体较大，为周生鞭毛，也可能会出现侧生鞭毛的现象，这是因为鞭毛断掉；铜绿假单胞菌菌体较小，为端生鞭毛）4.结果与分析4.1 实验结果在使用压滴法进行观察时，我们观察到假单胞菌的运动。在对本组四名同学制作的八个鞭毛染色的玻片进行观察时，均没有发现鞭毛结构。实验绘图另附。42

8、结果分析根据本组实验结果可知：某些细菌虽然微小，但是具有运动性。根据本组实验结果知，枯草芽孢杆菌结构呈细长状，多为链型，铜绿假单胞菌为椭圆状，多单个分布。通过观察其他组成功制得的鞭毛的玻片可知，枯草芽孢杆菌具周生鞭毛；铜绿假单胞菌具端生鞭毛。鞭毛染色失败的可能原因主要有以下几点：1.2.接种的菌种位于菌落中间，菌龄可能比较老，老龄的菌种的鞭毛极易脱落，因此染色后很难看见有鞭毛。 在盖玻片上接种的时候，用力过猛，动作太重太大，菌种的鞭毛就被刮落了。5.小结本次实验要求我们使用鞭毛染色法和压滴法对细菌的鞭毛形态和其运动性进行观察。因此在实验中我们首次接触到了鞭毛染色法和压滴法，经过实验后对其大致操

9、作已经基本了解。但是在实验中还有很多需要注意的地方，本实验中的注意事项：（1） 选用活跃生长期菌种进行鞭毛染色，老龄菌鞭毛易脱落。（2） 载玻片必须清洁、光滑、无油迹，否则菌液不能散开，造成菌体堆积，鞭毛相互纠缠而难以看清，而且染色后背景脏乱。（3） 制片过程中条件要温和，不能剧烈震荡、涂抹菌液，也不能采用加热法进行固定，否则鞭毛易脱落。（4） 硝酸银染液B液的使用方式和染色时间的掌握是本实验能否成功的关键环节。若时间过短或方式不当，就很难在媒染剂上着色，那么，我们也就没有办法在显微镜下观察到鞭毛了。（5） 本次实验的染色结果差强人意：菌体中鞭毛大都已脱落，而且染色后观察的菌体并不很清楚，有些太过密集，全都连成一片了。实验中，还有很多事需要注意，首先是载玻片上油迹比较多，多次进行清洁后效果可能仍然不佳，这可能是观察不清楚的原因；其次，接种的菌种位于菌落中间，菌龄可能比较老，老龄的菌种的鞭毛极易