申报11原料质量起草说明

1、化学药品1.1 类资料项目 11名称：血清胸腺因子资料内容：药品标准及起草说明，并提供标准品或者对照品研究机构名称：中国药品生物制品中国生化制药工业中心委员会技术研究机构地址：北京天坛西里 1 号、2 号研究机构：研究机构主要研究者姓名(签字)：试验参加者姓名：、淼试验起止日期：2006 年 12 月2010 年 10 月原始资料保存地点：中国药品生物制品(北京天坛西里 2 号）人姓名：中心药品申请人：山东生物科技血清胸腺因子Xueqing xiongxianyinzi Thymulin(Serum Thymic Factor STF；Facteur Thymique SeriqueGlu-A

2、la-Lys-Ser-Gln-Gly- Gly-Ser-AsnFTS)C33H56N12O16876.87本品为化学的由九个氨基酸组成的多肽，按无水与无醋酸物计算，含血清胸腺因子（C33H56N12O16）应为 95.0%105.0%。【性状】 本品为白色或类白色的粉末。本品在水中易溶，在甲醇、乙腈中不溶。比取本品，精密称定，加水制成 5mg/ml 的溶液，依法测定（中国药典 2010版二部附录E）。按无水与无醋酸物计算，比应为-45.0°至-55.0。【鉴别】（1）在含量测定项下的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（2）取本品约 1mg，加水 1m

3、l 溶解后，加碱性酒石酸铜试液 1ml，即显蓝紫色。【检查】 酸度 取本品加水溶解并制成每 1ml 中含 1.0mg 的溶液，依法测定（中国药典 2010 版二部附录H）,pH 应为 3.54.5。溶液的澄清度与颜色 取本品 加水溶解并制成每 1ml 中含 1.0mg 的溶液，溶液应澄清无色，如显浑浊，与 1 号浊度标准液（中国药典 2010 版二部附录B）比较，不得更浓；如显色，与黄色 1 号标准比色液（中国药典 2010 版二部附录A 第一法）比较，不得更深。醋酸 取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每 1ml 中含 0.5mg 的溶液。精密量取 50l，注入液相色谱仪，色谱图；另

4、取无水醋酸钠对照品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每 1ml 中含醋酸根（CH3COO ）10.5g 的溶液,同法测定。-按外标法计算峰面积，可得结果乘以醋酸根折算醋酸量的换算系数 1.0179，即得供试品中的醋酸（CH3COOH）的含量,含醋酸不得过 4.0%。有关物质 （1）高效液相色谱法取本品适量，精密称定，用相溶解并定量稀释制成每 1ml 中含 0.5mg 的溶液，作为供试品溶液。用相将供试品溶液稀释至 50倍，制成对照溶液（2%）。照含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液和对照溶1液各 20l，分别注入液相色谱仪，色谱图。按外标法计算各杂质含量，供试品溶液的色谱图中杂质峰，

5、除溶剂和醋酸峰外，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积 2.8%，各杂质峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积 4.5%。（2）毛细管电泳法取本品和对照品适量，加水制成每 1ml 中含 1.0mg 的溶液，作为供试品和对照溶液。照毛细管电泳法（中国药典 2010 版二部附录G）测定，分离柱75m57cm,检测波长 214nm；以 0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH2.5）为电极液，分离电压14KV；毛细管温度为 30。按峰面积归一化法计算各杂质含量，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积 2.5%，各杂质峰面积和不得大于对照溶液主峰面积 4.5%。氨基酸比值取本品适量，加 6mol/L 的盐酸

6、溶液 2ml,于 110水解 24 小时后，照适宜的氨基酸分析测定。以门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸及赖氨酸总数的七分之一作为 1，计算各氨基酸的相对比例，应符合以下规定:门冬氨酸 0. 901.10，谷氨酸 1.802.20、甘氨酸 1.802.20，丙氨酸 0.901.10，赖氨酸 0.901.10，丝氨酸 1.602.20。水分 取本品，照水分测定法（中国药典 2010 版二部附录M 第一法 A）测定含水分不得过 5.0%。细菌内毒素取本品，依法检查（中国药典 2010 版二部附录E）,每 1mg 血清胸腺因子中含内毒素的量应小于 25EU。【含量测定】 照高效液相色谱法（中国药典 2

7、010 版二部附录D）测定。柱，150相，流速色谱条件适用性试验用 HILIC 为固定相(如 TSK gelNH2-1004.6mm,3m)；以 0.05mol/L 磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）:乙腈=55:45 为1.0ml/min,柱温 30；检测波长 214nm。理论塔板数按本品主峰计算应不低于 3000。测定法精密量取 10l，注入液相色谱仪，色谱图；另取本品对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。【类别】肿瘤免疫调节药。【贮藏】遮光，密闭，于 28保存。 在保存。【制剂】注射用血清胸腺因子2血清胸腺因子质量标准起草说明一、概况本品为化学的由九个氨基酸组成的多肽，为新药一类

8、品种，由山东生物科技提供，尚未在各国上市，故中国药典、标准、英国、美国、欧洲药典均未收载，只能参照中国药典、英国药典、欧洲药典已上市的类似多肽品种做参考，并进行对比，本品质量标准进行逐项研究的基础上，制定了本品的质量标准。二、质量标准起草说明1、含量限度本品采用高效液相色谱法测定含量，按无水、无醋酸物计算含量，参国药典 2010版二部、英国药典、欧洲药典相似化学的多肽胸腺法新、生长抑素，降钙素、奥曲肽的限度进行对比，考虑到长期贮存和规模生产本品制定为 90.0%105.0%,三批样品检验结果为 99.8%101.6%。表 1 样品含量测定结果表拟定标准规定批号 061206批号 080701批

9、号 080809按无水、无醋酸物计算，含C33H56N12O16 应为 95.0%105.0%99.8%101.6%100.2%2、性状3 批样品留样观察，均为白色粉末，见表 2 样品外观检验结果表，颜色仍参考中国药典 2010 版二部相似多肽的标准制定为“白色或类白色粉末”。表 2 样品外观检验结果表拟定标准规定批号 061206批号 080701批号 080809白色或类白色粉末白色粉末白色粉末白色粉末溶解度本品的比项下的溶液，经溶解度检验样品，结果见表 3。将标准制定品在水中易溶，在乙醇、乙腈中不溶。本实验用冰醋酸试验其溶解度为不溶。表 3 样品溶解度检验结果表批号 061206批号 0

10、80701批号 080809在水中乙醇乙腈易溶不溶不溶易溶不溶不溶易溶不溶不溶比按中国药典 2010 版二部附录E。按无水，无醋酸物计算比，三批样3品测定结果见表 4，均符合规定。表 4 样品比检验结果表拟定标准规定批号 061206批号 080701批号 080809-45.0°-55.0°-48.2°-47.0°-49.1°3、鉴别中国药典2010 版二部类似多肽标准中的鉴别大部分采用薄层分析法，HPLC 法二种，其中亦采缩脲法测肽键的化学显色反应。考虑到本品结构中无芳香族氨基酸，故取双缩脲肽键显色反应。（1）HPLC 法照含量测定项下的试

11、验，分别供试品和对照品主峰的保留时间，三批样品每批样品取二次平均值，结果见表 5，保留时间一致。表高效液相色谱法测保留时间对照品批号 061206批号 080701批号 080809RT8.33min8.32min8.32min8.33min（2）取本品约 1mg，加水 1ml 溶解后，加碱性酒石酸铜试液 1ml，即显蓝紫色，三批结果见表。表样品的双缩脲反应拟定标准规定批号 061206批号 080701批号 080809肽键的双缩脲显色反应蓝紫色蓝紫色蓝紫色、检查（）酸度 因本品含有一定的酸性氨基酸，并且本品中含有醋酸，测 pH 值反映样品的一定性质。故配成 1.0mg/ml 的溶液，依法（

12、中国药典 2010 版二部 附录H）测定，其结果见表 7。表 7 样品的酸度检测结果拟定标准规定批号 061206批号 080701批号 080809pH4.114.124.07由以上结果拟定标准 pH3.54.5。（2）吸光度 是一个常规检测项目，考虑到本品不含芳香族氨基酸，故不应在 280nm有吸收，实测均无紫外吸收度。故标准中不订。（3）溶液的澄清度与颜色将样品制成 1.0mg/ml 的溶液，结果表明，三批样品均澄清无色。4表 8样品的澄清度拟定标准规定批号 061206批号 080701批号 080809澄清无色澄清无色澄清无色澄清无色（4）水分 水分直接影响原料药的质量，故常对水分进

13、行严格。依法（按中国药典 2010 版二部附录M）测定。结论见表 9，本规定为水分不得过 5.0%。表 9 样品的水分检测结果拟定标准规定批号 061206批号 080701批号 080809不得过 5.0%4.0%4.6%2.6%（5）醋酸含量由于本品中游离氨基，往往可与醋酸形成醋酸盐，使结构更为稳定，由于本品不宜用中国药典 2010 版二部附录N 中的多肽中的醋酸测定法，因醋酸出峰与主峰发生重叠现象，故另取新的 HPLC 醋酸含量测定法作品标准制定的。色谱条件与测定详见本品的质量标准研究。测定结果见表 10。表 10 样品醋酸含量检测结果（HPLC 法）拟定标准规定批号 061206批号

14、080701批号 080809不得过 4.0%2.39%2.00%2.15%学研究经精密度、RSD，本品的浓度范围 1.25-25g/ml。精密度其线性良。平均回收率也十分满意。表明用该法检测本品的醋酸含量准确、可靠。表 10-1样品醋酸含量测定精密度试验结果次数峰面积RSD1234562082721266211302057320407205501.66%5表 10-2 样品醋酸含量测定线性试验结果浓度（Y）g/ml峰面积线性回归方程1.252.55.010.015.025.0249855309736211303243054460Y=2200.3X-659.71r=0.9997表 10-3 样

15、品醋酸含量测定回收率试验结果样品回 收样 品浓度加入样品浓度 （mg/ml）加入对照品浓度（mg/ml）回收率%平均回收率%（mg/ml）0.005640.005640.005640.005640.005640.005640.005640.005640.005640.005641234567890.00880.00850.00860.01050.01070.01080.01290.01280.01270.0030.0030.0030.0050.0050.0050.0070.0070.007104.3%93.7%98.1%97.7%102.1%102.7%1033%102.4%101.1%100

16、.6%本品质量标准研究详见血清胸腺因子醋酸含量的学验证（各色谱图）。（6）有关物质化学的血清胸腺因子的原料中有关物质来自过程中引入的杂质或降解产物，为了有效的杂质多寡，本实验分别采用高效液相色谱法和毛细管电泳法对血清胸腺因子的原料的有关物质进行分析鉴定，得出相应结果，并定出相应的杂质含量限度。 高效液相色谱法 仪器与色谱条件均同含量测定项下的。测定取本品适量，精密称定，用相溶解并定量稀释制成每1ml 中含 0.5mg的溶液 ，作为供试品溶液。用相将供试品溶液稀释至 50 倍，制成对照溶液（2%）。各精密量 20l，注入液相色谱仪，色谱图至 30 分钟。按外标法计算各杂质含量，结果见表 11。6

17、表 11 用高效液相色谱法测样品的有关物质的结果批号杂质 1杂质 2杂质 3杂质总和0612060807010808090.17%0.16%0.17%1.79%1.64%1.61%1.12%1.09%1.09%3.09%2.89%2.88%通过以上结果分析，考虑到长期贮存可能的影响，单个杂质峰面积订为不得大于对照溶液主峰面积 3.0%，各杂质峰面积总和订为不得大于对照溶液主峰面积 5.0%，结果符合规定。 毛细管电泳法 仪器与条件详见本品的质量标准的研究。测定取本品适量，加水制成 1mg/ml 的溶液，按峰面积归一化法计算各杂质含量，结果见表 12。表 12 用毛细管电泳法测样品的有关物质结果

18、批号杂质 1杂质 2杂质 3杂质 4杂质总和0612060.5%0.4%0.4%0.8%0.8%0.8%0.5%0.4%0.4%2.0%2.0%2.1%3.8%3.7%3.7%080701080809通过以上结果分析，本品单个杂质峰面积订为不得大于对照溶液主峰面积 3.0%，各杂质峰面积总和订为不得大于对照溶液主峰面积 5.0%，结果符合规定。以上二法均能显示出本品在工艺中易产生少量杂质，法的灵敏度明显高于。学的验证为本品约在 0.00781-1.0mg/ml 检测范围内的线性，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标。得线性回归方程 Y=30609X-155.74r=0. 9992,线性，本法最低检测

19、限的浓度为 7g/ml，信噪比为 3。其检测结果准确、可靠。表 13 用毛细管电泳法测样品有关物质的学线性的验证浓度（Y）mg/ml峰面积线性回归方程0.0078130.0156250.031250.06250.1250.250.51.02334679181861370971891453930861Y=30609X-155.74r=0.9992（7）氨基酸的比值仪器和色谱条件详见本品的质量标准研究。7取中为最后结果，以门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸及赖氨酸总数的七分之一作为 1，计算各氨基酸的相对比例，测定结果见表 14。表 14 样品的氨基酸比值检测结果061206080701080809

20、氨基酸残基理论值测定值理论值测定值理论值测定值Asp Glu Ser Gly AlaLys1222111.02.01.72.01.01.01222111.02.02.01.71.01.01222111.02.01.72.01.01.0考虑到水解全或部分水介质中被破坏的程度有所不同，参照中国药典 2010 版类似多肽的测定及结果，应符合以下规定：门冬氨酸 0. 91.1，谷氨酸 1.82.2，丝氨酸 1.602.20，甘氨酸 1.82.2，丙氨酸 0.91.1，赖氨酸 0.91.1，结果符合规定。（8）细菌内毒素按中国药典 2010 版二部附录E 细菌内毒素的检查法，进行了方法学的摸索和验证，详

21、见本品质量标准研究中的细菌内毒素的检测与学验证。规定本品每 1mg 含内细菌毒素的量应小于 25EU，三批结果检测均符合规定。（9）残留溶剂由于本品工艺是纯化学，其过程中使用 DMF，二氯甲烷、甲醇、乙醚等进行纯化，洗涤。本实验采用顶空的气相色谱法对二氯甲烷、甲醇、乙醚进行检测。其三批结果只检测出甲醇 0.006%（符合药典规定），其中乙醚、二氯甲烷均未检出。另外采用直接法对 DMF（详见本品的质量标准研究），三批均未检出 DMF。为此，本标准不定残留溶剂项。5、含量测定用高效液相法对本品进行检测。其三批结果为 99.8%101.6%，考虑到今后大规模生产，故制定含量范围为 90.0%105.

22、0%，亦完全符合中国药典 2010 版二部类似多肽含量的限度范围。此外对系统的学进行了系统适应性试验的研究。（详见本品质量研究工作的试验资料）。现将主要结果表述如下：8表 15-1 本品含量测定精密度试验结果次数峰面积RSD1234561935190119131960191719311.07%表 15-2 样品含量测定稳定性试验结果时间（小时）峰面积RSD02468167316811688169516970.59%表 15-3 样品含量测定线性试验结果浓度（Y）g/ml峰面积线性回归方程0.150.30.50.81.01.259911861963317939574693Y=3923.7X+13.057r=0.9998表 15-4 样品含量测定回收率试验结果样品回收率样品峰