DNA浓度和纯度的测定

1、DNA浓度和纯度的测定一、原理DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在 260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关， 也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为 1卩g / ml时，DNA钠盐的OD260 = 0.02当OD260= 1时，dsDNA浓度约为50卩g / ml ssDNA浓度约为37卩g / ml RNA浓度约为40卩g / ml 寡核苷酸浓度约为30卩g / ml （youyu底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响 DNA吸光 度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的 OD260

2、、OD280和OD230,计 算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯 DNA : OD260 / OD280" 1.8 （> 1.9,表明有 RNA 污染；V 1.6，表明有蛋 白质、酚等污染）纯RNA : 1.7 V OD260 / OD280V 2.0 （V 1.7时表明有蛋白质或酚污染； > 2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。二、材料、试剂及器具1、材料提取的PUC19样品、PUC19标准样品2、试剂灭菌重蒸水，TE缓冲液3、器皿石英比色皿；UV-240紫外分光光度计二

3、、实验步骤1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.2、用重蒸水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。3、设定狭缝后校零。4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA 5卩l或RNA 4卩l用TE缓冲液稀释至1000卩I）后，记录编号和稀释度5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。6 设定紫外光波长，分别测定 230nm、260nm、280nm波长时的OD值c7、 计算待测样品的浓度与纯度。DNA样品的浓度（卩g /卩l） :OD260X稀释倍数X 50/1000RNA样品的浓度（卩g /卩I）: OD260X稀释倍数X 4

4、0/1000方案二溴化乙锭法一、原理溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个扁平的基团可插入到DNA或RNA链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。DNA吸收254nm的紫外辐射并传递能量给 EB，而EB本身在302nm和366nm 处有光吸收。吸收的能量在590nm处释放，并表现为橙红色荧光。结合的EB的 荧光产率远大于游离EB的荧光产率。EB结合量的多少与DNA的大小和构型有 关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。 对于单一构型的同种 DNA样品来说， 溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的 DNA含量成正比。二、材料、试剂及器具1、标准DNA羊品：已知浓度的线型DNA以

5、TE稀释为梯度浓度的一系列标准样 品。2、质粒DNA的酶切样品（待测）3、溴化乙锭（EB） 5卩g / ml :以PH8.0的TE稀释10mg/ml母液而的。4、紫外透射仪。三、操作步骤黑色塑料板（或其他替代物）在其上点上两排溴化乙锭2卩l液滴，每排六点取标准样品2卩l与第一排溴化乙锭混匀，则各点的 DNA浓度分别为（单位：ng/ 卩 I ） :20、15、10、5、2、1取待测样品经过梯度稀释后，各加 2卩l于第二排的溴化乙锭上混匀梯度稀释（单位：卩l ）把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上关好样品室门。以短波紫外光激发荧光。观察每一点的荧光强度或拍照。比较上下两排得亮度，确定待测样品的浓度

6、四、注意事项1、标准样品含单一种类的DNA且大小与待测样品相近。2、待测样品和标准样品使用同样的体积.3、EB具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、 眼晴、口鼻等。4、沾有EB的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。五、实验报告1、绘出所观察到的现象（以点的密度代表亮度）2、请估算待测DNA原液的浓度。要求记录测定原始数据，计算待测样品的浓度和纯度；并对你的实验结果作出评 价，提出下一步提纯工作的设想。琼脂糖凝胶电泳检测DNA采用1%的琼脂糖进行电泳，实验步骤为：a. 制胶：称取0.2g琼脂糖转入三角瓶中，加入20mL 1 >TAE，混匀，于微波 炉中加热融化。稍冷却后，加入1丄EB溶液（10mg/mL），倒入预先插入梳子 的凝胶槽（12cn>12cm）内。待胶凝固后，竖直拔出梳子；b. 上样：在水平电泳槽中加入1XTAE电泳缓冲液，将凝胶槽转移到电泳槽（HE-120,上海天能科技有限公司）中，保证缓冲液的液面高于凝胶表面。在 封口膜上将5丄DNA样品和1此6 >Oading buffer混合均匀，然后小心的加入到凝 胶的点样孔中。Marker为入DNA/Hind III ,上样量为5此。c. 跑胶：确认样品孔所在的一