子宫内膜异位症的实验研究进展（第二部分）.docx

1、子宫内膜异位症的实验研究进展(第二部分)二、体外细胞模型为了探索一种获得高产量、高纯度子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的分离培养方法，建立了子宫内膜异位症体外细胞模型。子宫内膜细胞是性 激素作用的靶细胞，在月经周期中发生着形态与功能的变化。体外分离培 养子宫内膜细胞可避开在体子宫内膜的不同成分对刺激反应的不一致及1=1研究的局限性，是分析这些细胞功能及其相互作用的基础，可以对细胞的 生长、分化、代谢及激素作用机制进行研究，为研究内异症的发病机制及 筛选临床治疗药物提供有用的手段。并且在位内膜标本量充足，较异位内 膜更易获得，因此内异症在位内膜细胞体外培养可作为研究子宫内膜异位症的较好体外模型。(-

2、)单细胞培养模型早在20世纪70年代就有人分离出正常人体子宫内膜或腹膜单种细胞, 并进行体外培养。之后随着细胞培养技术的普及发展，子宫内膜基质细胞、 腺细胞及腹膜间皮细胞的体外培养成功，细胞的各种特性及在各种干预下 发生的改变得到了广泛而深入的研究，极大丰富了人们对于子宫内膜异位 症细胞水平的认识。Gentilini D等将来自子宫内膜异位症患者及对照组的子宫内膜基质Fasciani等报道将人子宫内膜碎片剪至1mm大小,包埋于纤维蛋白原和 凝血酶混合形成的凝胶中持续培养存活100天，子宫内膜碎片细胞能增生、 侵袭基质,形成新的腺体和血管。也有直接将内膜置于培养基中存活5天 的报道。此后还有子宫

3、内膜组织的凝胶培养和鸡胚培养的报道。子宫内膜 组织培养成功后，人们尝试用组织培养方法建立内异症模型以探索其早期 发病过程。由于内异症发病机制中最为广泛接受的仍是1927年Sampson 提出的经血逆流种植学说，故子宫内膜异位症组织学模型主要建立在这一 学说基础之上，常有以下两种模型。(-)人体组织学模型关于内异症人体组织学建模方法国内报道极少，国外也只有几家机构 的少量研究报道，没有文章系统阐述如何建立子宫内膜异位症人体外组织 学模型，且各家所述培养条件不一致,所得结果也差异较大。子宫内膜异位症人体组织学模型是应用人在位子宫内膜组织处理成 碎片置于腹膜或羊膜培养观察子宫内膜组织与腹膜间皮及间皮

4、下组织相 互影响后的生物学行为，是在组织培养的基础上研究内异症的发病机制, 其前提是子宫内膜和腹膜组织经体外培养后能成功维持其组织结构和功 能。摸索一套简单易行、结果可靠的子宫内膜和腹膜的组织培养技术是实 验的前提和基础。其建立的关键点在于：随经血逆流入腹腔的子宫内膜碎 片，必须首先迅速与腹膜粘附，并进一步穿透腹膜基底层发生侵袭和形成 新生血管才能存活并致病，粘附和侵袭是内异症发病启动的关键步骤。用 人体组织学模型了解这一过程，并了解在位内膜在这一过程中的作用，对 最终阐明内异症的发病机制具有重大意义。1 .人体组织学模型的建立人体子宫内膜可以种植于腹膜，也可以种植于羊膜,而羊膜由于和膜 膜结

5、构相似而不似腹膜那样脆弱易损伤且容易获得标本受到了部分学者 的青睐，但毕竟羊膜和腹膜有着肯定的区别且非同一个体来源，故最常用 的仍是子宫内膜与腹膜共培养模型。具体操作方法：通过内膜活检、刮宫、月经血或切除的子宫获取内膜标本，通过腹腔镜或开腹手术采集腹膜标本,然后将内膜机械分离或酶消化至I2mm,小心剔除腹膜下脂肪和血管，将腹膜间皮面朝上铺于培养皿中，其上种植子宫内膜碎片，培养一定时间后将子宫内膜和腹膜一起固 定切片观察子宫内膜与腹膜粘附部位的细胞学表现。操作时需注意：腹膜很薄，间皮层脆弱易损伤,处理时要轻柔；酶消 化的子宫内膜碎片粘附能力减弱；月经血收集专用的月经杯置于阴道顶部, 收集月经第1

6、3天经血,离心过滤收集内膜碎片;强调子宫内膜组织的 培养条件，有研究显示将子宫内膜置于架上培养,位于气液平面培养的子 宫内膜组织块组织形态维持要优于置于培养液中培养的组织块，且维持时 间要延长,且子宫内膜腺体维持存活时间较间质细胞要长,分析其原因可 能与不同的组织来源其营养物质代谢方式不同有关,此结果与Sophie Debrock的实验结果相符，他将人子宫内膜剪碎至1 2mm接种腹膜最 长培养7天，发现子宫内膜腺体存活而间质细胞坏死。另外子宫内膜组织 培养时间最长不要超过1周，时间过长组织结构尽失，失去研究意义。最 佳研究时间为离体培养23天之内，这个时期内组织结构和细胞形态和 体内近似，能体

7、现在体的生理特点。2.人体组织学模型的分析(1 )子宫内膜粘附腹膜的条件腹膜间皮层的完整性与粘附的关系子宫内膜异位症人体组织学模型自建立以来，完整的腹膜间皮层是否 是妨碍子宫内膜组织粘附腹膜的屏障这个问题一直是讨论的热点。1996 年van derLinden PJ等首次将人子宫内膜组织块和羊膜共培养建立人体 组织学模型即提出子宫内膜组织只粘附间皮层缺损的羊膜，此后 Groothuis和Koks CA等用羊膜或腹膜进行的一系列研究支持其观点，认 为连续的腹膜间皮层是子宫内膜粘附腹膜的屏障。Sophie Debrock等也 发现子宫内膜粘附部位腹膜间皮层大部分粘附处破坏。但Witz CA等自 9

8、9年开始用相同模型进行的一系列研究有力地辩驳了这种观点。他观察到 子宫内膜碎片可以和完整的腹膜间皮层粘附并发生侵袭，并且子宫内膜粘 附和侵袭发生的时间很早，I小时即可见到粘附，I 18h可以发生基质细 胞侵袭腹膜间皮层,同时首次用电镜观察到子宫内膜细胞和腹膜间皮细胞 通过微绒毛发生接触，用免疫荧光三维重建技术和细胞学模型清楚观察到 了粘附和侵袭的过程。此夕卜，D'Hooghe TM等用狒狒模型Nisolle M等 用裸鼠模型的研究也认为子宫内膜能与完整间皮层的腹膜粘附。而 Jonecko A等认为cytokeratin是腹膜间皮层最重要的标志物,能反映潜 伏于组织内部的间皮细胞情况。W

9、itz等采用免疫荧光方法检测腹膜间皮层 cytokeratin8来判断腹膜间皮层的完整性。腹膜间皮层缺损导致子宫内膜碎片粘附可以用部分研究结果解释。正 常腹膜间皮细胞表面由糖蛋白和氨基葡聚糖形成一层阴性电荷界面，防止 细胞和组织粘连，而当腹膜间皮层破损时有纤维素沉积，对子宫内膜有非 特异性捕获功能。整合素介导子宫内膜与间皮层破损的腹膜细胞外基质粘 附。子宫内膜组织块条件子宫内膜所处月经周期，分离方法等与粘附也有一定关系。Witz CA 研究发现增殖期、分泌期和月经期的子宫内膜碎片均可以和腹膜发生粘附。 NisolleM等也认为月经期、增殖期和分泌期子宫内膜碎片均可以成功种 植裸鼠腹腔。Groo

10、thuis等发现增殖期子宫内膜较分泌期子宫内膜在羊膜1=1细胞外基质上扩展生长明显。但Witz结果显示子宫内膜分泌期和增殖期 粘附情况类似。另外子宫内膜组织分离方式也影响组织粘附。van der Linden PJ等 在研究中将子宫内膜分成酶消化分离组和剪切分离组，发现组织经酶消化 后大部分为单个细胞，缺乏表达钙黏蛋白和整合素，不能粘附羊膜基质； 而剪切分离的组织表达黏附分子,粘附羊膜基质。2003年Annemiek W.Nap等用鸡胚模型研究发现胶原酶消化处理的子宫内膜碎片丧失侵袭 形成内异灶的能力。子宫内膜粘附腹膜的方式Witz CA等于1999年研究发现子宫内膜组织块粘附腹膜过程中只有|

11、=|子宫内膜基质细胞介导粘附，没有腺上皮细胞粘附；而2001年进一步研 究发现子宫内膜基质细胞和腺体均可以和腹膜粘附。Koks等发现子宫内 膜腺体和基质均能介导粘附羊膜。单个子宫内膜细胞能否与腹膜粘附还不能定论。Wild RA等将子宫内 膜间质细胞和子宫内膜碎片种植于人腹腔液分离的间皮细胞培养的单层 细胞上，子宫内膜碎片能生长形成内异症样结构,而子宫内膜间质细胞则 不能。van der LindenPJ等发现子宫内膜酶消化后大部分为单个细胞,缺 乏表达钙黏蛋白和整合素，不能粘附羊膜基质。Beliard A等将混合培养 的子宫内膜基质和腺细胞注入裸鼠腹腔后2周能形成异位灶，而单独注射 腺细胞或基

12、质细胞不能形成异位灶。而WitZ CA等观察到月经血中单个子 宫内膜腺细胞或基质细胞均能和腹膜间皮层粘附。(2)子宫内膜侵袭腹膜的条件子宫内膜组织块大小及其细胞构成影响其对腹膜的侵袭。Koks等发现大多数情况下，月经血脱落的子宫内膜碎片仅由腺体和基质细胞其中一种构成，这种碎片能粘附羊膜和腹膜，但不能侵袭和形成内异症样病灶。2003年Annemiek W.Nap等用经期脱落的子宫内膜碎片和经间期活检获取的子宫内膜碎片种植于鸡胚模型，发现只有包含腺体和间质的组 织块(一般直径大于1 mm力能发生侵袭和形成子宫内膜异位症样病变, 经血中分离的单个子宫内膜细胞不发生侵袭和形成病变，认为月经期脱落 的子

13、宫内膜碎片的完整性可能是内异症形成的重要因素。Nisolle M等认为子宫内膜腺细胞和基质细胞功能不一,基质细胞介入粘附过程，而子宫 内膜腺细胞介导病灶的生长。近期有研究将子宫内膜碎片控制在直径0.5-Imm左右进行研究，结果显示绝大部分能见到子宫内膜腺体和基质，很小|=|部分子宫内膜仅由基质细胞构成，这两种结构的子宫内膜与腹膜均粘附良 好，多天培养后均能见到明显腺体和基质细胞的间皮下侵袭。因此认为仅 由子宫内膜基质细胞形成的碎片也能侵袭腹膜，组织块中子宫内膜腺体和 基质细胞均能发生侵袭。(3)子宫内膜粘附与侵袭腹膜的时间Groothuis将子宫内膜接种腹膜培养16小时发现子宫内膜碎片粘附 间

14、皮层缺损的腹膜。Witz则对子宫内膜组织粘附和侵袭腹膜的具体时间进 行了研究，他用增殖期和分泌期的子宫内膜碎片种植腹膜培养I小时，光 镜下见到明显的子宫内膜与腹膜的粘附，但未见到侵袭,电镜下发现子宫 内膜细胞早期通过微绒毛与腹膜间皮细胞接触；而培养至18小时发现子 宫内膜基质细胞经间皮细胞的侵袭，由此判断子宫内膜侵袭腹膜发生时间 是1 18小时之间，其判断子宫内膜组织侵袭腹膜的依据是子宫内膜粘附 处腹膜间皮层缺损而其周围的间皮层完整，并未见到明显间皮下侵袭。 Witz CA在其后的另一项细胞模型的研究中观察了侵袭的具体过程，他在生长成层的腹膜间皮细胞上加入子宫内膜腺细胞、基质细胞和子宫平滑肌

15、细胞混合培养，所有细胞均荧光标记，用三维共聚焦激光扫描显微镜观察|=|子宫内膜细胞对于间皮层的粘附和侵袭，I小时发现子宫内膜腺细胞、 质细胞和子宫平滑肌细胞均与间皮细胞层粘附，6小时两种子宫内膜细胞 均有伪足伸入间皮细胞之间的连接,12小时由于子宫内膜细胞的潜在破坏 使将间皮细胞拱起，同时间皮细胞出现空泡，而平滑肌细胞没有侵袭行为。Sophie Debrock将子宫内膜接种于腹膜培养3 7天，发现间皮层大部|=|分粘附处破坏,粘附的子宫内膜大部分为基质细胞，并见到多层基质细胞 的侵袭，移植体表面子宫内膜上皮化，腺体存在而间质细胞坏死。Annemiek W.Nap将活检的子宫内膜碎片接种于鸡胚模

16、型,发现48小时 形成明显的侵袭,72小时绒毛膜尿囊膜下基质中出现子宫内膜基质包绕腺体的异位症样病变。增生性标记物Ki67证实侵袭的子宫内膜细胞来源m种植的子宫内膜碎片，而非局部细胞增殖形成。3.人体组织学模型的应用：用于探索子宫内膜组织培养条件及子宫内膜组织与腹膜组织粘附的培养条件；用于分析子宫内膜与腹膜粘附的细胞学行为及分子生物学表现；用于对比研究内异症和非内异症患者子宫内膜与腹膜的粘附特点； 用于观察内异症发病早期子宫内膜与腹膜组织粘附、侵袭等过程； 用于模拟在体早期发病过程；用于内异症发病机制、发病过程和药物治疗等方面的研究方。4.人体组织学模型的评价:人体组织学模型的优点:模拟程度高

17、:它直接反映了人体子宫内膜与人体腹膜的相互作用，也间接反映了组织内不同细胞间的相互影响； 可动态观察内异症患者在发病早期在位内膜与腹膜组织粘附、侵袭并形成 新生血管的连续过程，得到直接组织学证据;可比较分析内异症和非内 异症患者在位内膜和腹膜的异同，为进一步探索病因提供途径;资源丰 富，可行性好。人体组织学模型的缺点:由于标本主要来源于人体，人体组织学模型 还要同时获取腹膜，标本来源受到很大限制;组织离体培养的时间局限性 导致模型只适用于早期发病机制研究;组织离体培养后其生理特性会发生 变化，且脱离了在体的腹腔微环境影响，不能完全反映在体情况。（二）鸡胚模型Murphy于1912年成功创建鸡胚

18、模型,用于肿瘤细胞的侵袭研究。 鸡胚绒毛尿囊膜由外向内由绒毛尿囊膜（夕卜胚层）,疏松结缔组织和血管 （中胚层）,尿囊膜（内胚层）构成。Maas等于2001年率先报道了鸡胚 模型用于子宫内膜异位症的研究。Nap AW等成功地用鸡胚模型进行了内 异症的侵袭和血管形成的干预实验。研究表明，鸡胚模型是研究内异症发 病早期过程的很好模型。鸡胚模型的建立：受精鸡蛋在37°C , 55%相对湿度的环境下间断旋 转孵育3天后，蛋壳开窗1 x|.5cm ,取出2ml蛋清,密封蛋壳开口，继 续静止孵育至第10天。由于绒毛膜尿囊膜是由双层上皮细胞组成，细胞 不能穿透,只有破坏表层细胞留下底层细胞后细胞才能

19、穿透，方法采用浸 有乙醍的消毒擦镜纸贴于膜表面之后立即揭下，破坏表层细胞留下底层细 胞，这样处理后的绒毛膜尿囊膜表面可以用来种植子宫内膜碎片，内膜种 植后密封窗口，继续孵育1-3天终止，观察内膜碎片的粘附和侵袭情况（见 图 1 -10对鸡胚模型进行研究，结果发现24小时即可发现子宫内膜腺体和基 质细胞发生侵袭,72小时绒毛尿囊膜下的中胚层出现内膜基质细胞围绕腺 体的内异症样病灶并有鸡胚血管长入其中供给营养，用核酸探针检测病灶 确系人来源细胞；未发现单个腺细胞发生侵袭，考虑腺细胞发生侵袭的前 提条件是彼此之间须有连接和同基质细胞发生接触。综上所述，所有这些模型都有不同的优点和局限性，应用于内异症

20、的 不同研究领域，彼此之间优势互补,共同服务于内异症的基础研究,没有 哪种模型能涵盖内异症的所有研究领域。综合研究方向、实验室条件选择 合适的实验模型是研究者最重要的选择。细胞分离培养后，经或不经170雌二醇、孕激素及血小板源生长因子 (PDGF-BB )培养24小时后,利用博伊登小室(Boyden chamber) 进行趋化实验，分析不同来源的细胞在激素作用下的趋化作用差异，得出 雌激素可以导致基质细胞迁移能力增强，但孕激素只对病例组基质细胞有 增加迁移的作用，PDGF-BB对各组作用物明显差异，该现象可能与细胞 骨架结构的改变相关。然而，通过研究的进展，人们认识到子宫内膜异位症的发生发展并

21、非 单种细胞所为，而是多种细胞相互影响后共同发展的结果，单种细胞培养 模型已不能满足子宫内膜异位症模型的研究，但在非模型研究的其它领域 单细胞培养方法的应用仍十分厂泛，也取得了很多可喜得进展。(二)多种细胞共培养模型可以简单地将几种细胞混合在一起培养，也可以分置两室培养，室间营养物质包括细胞因子自由流通，观察细胞间的相互影响。Beliard A等2002年研究发现混台培养的子宫内膜基质和腺细胞注入裸鼠腹腔后2周后能形成异位灶，而单独注射腺细胞或基质细胞不能形成异位灶。Sharpe|=|KL等分别将大鼠的子宫内膜基质细胞和腹膜间皮细胞、腺细胞和腹膜间皮下细胞分置于一种特殊的双孑L小室培养，两孔之

22、间培养液能自由流通，结 果发现腹膜间皮细胞能诱导子宫内膜基质细胞增生和聚集，间皮下细胞诱 导腺细胞增生和聚集；而腹膜细胞不受子宫内膜细胞的影响。Yamauchi N1=1等将牛子宫内膜腺细胞和基质细胞在维生素C刺激下旋转培养多天形成子 宫内膜样结构。随着细胞研究的深入，人们注意到细胞外基质和细胞的组 织结构显著影响细胞的生物学行为。人们开始模仿体内子宫内膜和腹膜的 组织结构进行研究。（三）多种细胞三维培养模型1994年Bentin-Ley U率先报道了子宫内膜基质细胞和腺细胞三维培养方法。具体研究方法为：胶原蛋白混合物模拟细胞外基质，其内包埋子 宫内膜基质细胞；Matrigel胶充当基底膜；子

23、宫内膜腺上皮细胞培养于基 底膜表面。这种三维培养模拟正常子宫内膜的生理结构，用这种摸型培养子宫内膜上皮细胞呈单层极性分布，核位于基底部，表面绒毛和纤毛可见。2002 年 YangH等基本复制了这一模型，不同的是将子宫内膜腺细|=|胞包埋于Matrigel胶中，48小时电镜检查发现:胶原层上腺细胞形成单 层柱状细胞，顶部有微绒毛，细胞间有紧密连接和桥粒连接，与在体子宫 腺上皮细胞结构类似。免疫组化分析其功能特点和在体内膜也基本一致。2003年Park DW再一次复制了这一模型,观察结果与前人一致,认为这 种培养模式可以用来分析子宫内膜细胞之间或子宫内膜细胞与其他细胞 相互作用下的生物学表现,还可

24、以用来分析内膜癌的侵袭行为。近年来有 研究将胚胎干细胞三维培养形成新生血管，三维培养考虑到了氧和营养物 质梯度，细胞间PH值随深度的改变模拟组织内微环境的氧化还原状态，因此在模型应用中有较大价值及研究空间。在模型建立方面，尝试最多且成果显著的应为Witz CA教授,2003 年Witz在生长成层的腹膜间皮细胞上加入子宫内膜腺细胞、基质细胞和 子宫平滑肌细胞混合培养，所有细胞均荧光标记,用三维共聚焦激光扫描 显微镜观察子宫内膜细胞对于间皮层的粘附和侵袭，发现1小时子宫内膜 腺细胞、基质细胞与间皮细胞层粘附，6小时两种子宫内膜细胞均有伪足 伸入间皮细胞之间的连接,12小时间皮细胞拱起，同时间皮细胞

25、出现空泡。 在此基础上,Lucidi于2005年建立了子宫内膜异位症细胞黏附模型，使 腹膜间皮细胞在96孔板中生长,当细胞完全融台后,收集培养第2-3代 Calcein-AM标记的子宫内膜基质细胞放置于腹膜间皮细胞上，37。培养 1小时，倒置浸入装有磷酸缓冲溶液（PBS ）容器经20rpm轨道搅拌机摇 晃15分钟，使未粘附的细胞脱落，荧光显微镜观察细胞粘附数量。2008 年Nair建立了一种可以评价细胞侵袭的模型，让腹膜间皮细胞在直径80um的Matrigel膜表面生长融合成层后，将子宫内膜基质细胞置于其上生长，两种细胞分别荧光标记，连续观察24小时,得出共培养I小时子 宫内膜基质细胞粘附于腹

26、膜间皮细胞表面；6小时子宫内膜基质细胞侵袭 到腹膜间皮细胞下方；12小时子宫内膜基质细胞延展，开始穿过80um|=|小孔，同时，腹膜间皮细胞在已向下方侵袭的子宫内膜基质细胞表面增殖, 将其覆盖；24小时子宫内膜基质细胞侵袭到Matrigel膜下方,并伸展生 长。应用这两种模型已经开展了大量的有关子宫内膜异位症的研究，如 Ferreira等利用激活素A、抑制素A、卵泡抑素分别处理子宫内膜基质细 胞后与Matrigel膜表面生长成层的腹膜间皮细胞共培养，发现激活素A 可以促进子宫内膜基质细胞的侵袭，但对粘附数量及细胞增殖无明显影响, 这种效应可以被抑制素A、卵泡抑素逆转。Kaboussi等利用子宫

27、内膜基 质细胞系EM42 ,腹膜间皮细胞系LP9进行研究，过氧化物酶体增生物激 活受体Y （ PPARy ）激动剂嚷哩烷二酮（CTZ ）分别处理上述两种细胞后 两两交叉培养，结果发现单独处理LP9并不影响细胞粘附，但EM42经 CTZ处理后可以降低增殖、粘附及侵袭。当两者都经CYZ处理后,粘附 率可降低至37%。这些因素可能都与子宫内膜异位症旱期病灶形成相关。然而，虽然经以上研究我们证实了子宫内膜基质细胞对腹膜间皮细胞 的粘附及侵袭现象，但在两种细胞接触到粘附侵袭形成过程中，细胞间发 生的变化我们不得而知。因此，随着软刻蚀技术、微流控及电化学修饰技 术的广泛应用，可以控制多种细胞在同一表面有序

28、粘附，已使在纳米水平 观察细胞间相互作用成为可能。（四）控制同一表面多细胞共培养模型此模型能在同一表面控制不同种细胞有序粘附，对多种细胞的微观生 物学行为进行观察。然而目前该模型在生物学方面的应用未见报道。将该 模型应用于子宫内膜异位症体外细胞共培养模型的研究中，可以观察子宫 内膜基质细胞与腹膜间皮细胞之间粘附、侵袭的发生过程，从而可以在体 外模拟逆流的经血中子宫内膜基质细胞进入腹腔后内异症发病的过程，对进一步阐释子宫内膜异位症的发病机制有重要的意义。目前的研究多为基于表面化学或微流控技术建立的共培养模型。利用 电化学方法处理的自组装单分子膜是通过不同末端基团的烷炷硫醇分子 的头基(硫醇)和基

29、底(金属金)之间产生化学吸附,在界面上自发形成 有序的单分子层，该方法达到的两种细胞共培养是非侵入式的，然而合成 过程复杂。有学者采用旋转涂布把抗拒蛋白质和细胞黏附的带负电的透明质酸 (hyaluronic acid HA )涂布在干净的硅片表面,常温固化，然后把经等 离子清洗器处理过的具有一定图案的聚二甲基硅氧烷(PDMS )印章放在 薄膜表面,高温加热，涂布在硅表面的HA液化，由于毛细吸力的作用使 得液态的HA全部填充到PDMS印章的空隙处,常温固化后，形成规则图 案的HA ,而硅片上其他区域是干净的硅表面。这时接种第一种细胞，黏 附到硅片上没有附着HA的区域，然后加入带正电的多聚赖氨酸,

30、让它与 HA结合从而使得HA表面变为可以吸附蛋白质和细胞。这一系统已经用 于肝实质细胞或胚胎干细胞与成纤维细胞共培养，证明这一方法具有对多 种细胞的适用性。而Co等提出,在生物可降解壳聚糖和凝胶的基底上, 通过多层组装抑制和促进细胞生长的离分子电解质，达到两种细胞的共培 养。具有抗拒细胞黏附的甲基丙烯酸寡乙二酸P甲基丙烯酸共聚物 poly-oligoethyleneglycolmethacrylate-co-rnethacrylic acid , poly- (OEGMA-co-MA )由于自身带有负电荷，可以通过微接触印刷的方法1=1转移到壳聚糖基底上面，人血管内皮细胞被接种到这一表面，在没

31、有共聚 物的裸露壳聚糖上黏附和增殖形成细胞层，然后把黏附细胞的基底放入壳 聚糖溶液中，由于其带正电荷，通过正负电荷作用，壳聚糖结合在非细胞生长区域。最后把第2种细胞接种到表面,达到两种细胞共培养的目的。Wittstock等则用超微电极调控寡聚乙二醇（OEG ）的性质,OEG可 以被如Br2等试剂氧化而使其失去抗拒细胞黏附的性质，改变为促进细胞 黏附。而Br可以通过电化学的方法变为Br2。所以把修饰了 0EG的金片1=1放入磷酸缓冲溶液中，通入电压，可以选择性地把基底表面的性质改变。先把一些区域表面活化，待接种的第一种细胞在活化区域长满后，再进行 第二次活化，接种第二种细胞，这样实现多种细胞的共

32、培养。并可以实时 原位的控制细胞黏附在特定修饰位置。基于微流控通道的方法也可以用来在同一表面培养多种细胞。Whitesides等运用三维微流系统内部复杂的网络通道，可以把多种蛋白 质或多种细胞以不同的图案吸附或黏附在平的基底表面。对标准的三维微 流管道拓扑结构分析得出：两层相互连通的沟道系统，可以在平的基底表 面做出任意图案所以如果要在平面上做出任意图案，节点可以认为是需要 的图案，这样只需要两层沟道系统相互连接就可以制备任意（连续和不连 续）的复杂图案。按设计得到的印章可以反复应用，当细胞被图案化后, 拿开印章，细胞就可以自由移动，从而达到接触及相互作用,且可以在表 面制造出所需的任意图案，这种方法对于体外研究细胞间相互作用提供了有效的手段。综上所述，目前对于体外细胞培养的模型及手段多种多样，其最终目 的都是尽可能的模拟生理状态下多种功能相关细胞的生存环境、特点等, 通过体外观察明确细胞间相互作用的机制，疾病的发生发展过程，为疾病 的源头治疗提供可能的依据。三、体外组织学模型模型建立是研究内异症的重要手段。尽管已成功构