抗菌药物诱导性肠球菌耐药的实验研究

1、抗菌药物诱导性肠球菌耐药的实验研究*    关键词： 肠球菌     【摘要】 目的 深入研究肠球菌耐药性的产生机制，指导临床合理用药。方法 采用一步诱导法，对8株粪肠球菌、2株屎肠球菌和9株粪肠球菌、1株屎肠球菌进行四环素和左氧氟沙星诱导性耐药试验。对诱导出的菌株用琼脂稀释法测定药物敏感性；用PCR法检测四环素耐药基因tetM、tetL，用PCR法扩增gyrA、parC基因后测定DNA序列。结果 10株实验菌中的2株诱导产生了多株稳定的四环素耐药株。耐药株的MIC分别为16128g/ml，与原株（MIC0.25g

2、/ml、2g/ml）比较，增加了16512倍。在1株实验菌的诱导耐药株的质粒DNA上检测到tetL耐药基因，另一株实验菌株的诱导耐药株的染色体DNA上检测到tetM耐药基因；10株实验菌中的2株诱导产生了多株稳定的左氧氟沙星耐药株。诱导耐药株的MIC分别为1664g/ml，与原株（MIC 2g/ml、2g/ml）比较，增加了832倍。GyrA的QRDR内的第87位或第83位的氨基酸及ParC的 QRDR内的第80位的氨基酸均发生了改变。结论 一步法抗菌药物诱导性耐药试验的结果表明，肠球菌可在高于耐药MIC浓度的抗菌药物短期作用后获得耐药性。    【关键

3、词】    肠球菌 抗菌药物 诱导性耐药 抗菌药物压力    Laboratory study of antibacterial agents on enterococcus induced resistance     【Abstract】 Objective The purpose of the present research was to study on the emergence mechanism of enterococcal resistance to a

4、variety of antibacterial agents，and to guide the selection and use of antimicrobial agents in clinical practice.Methods Eight of faecalis enterococcus and two of faecalis enterococcus，nine of faecalis enterococcus and one of faecium enterococcus were selected to performed experiments on induced resi

5、stance to tetracycline、levofloxacin respectively by one-step method.The susceptibility of the induced strains resisitant to tetracycline、levofloxacin was measured by determining the MIC using agar dilution method. The tetM and tetL gene in the induced strains were detected by PCR， gyrA and parC gene

6、 were amplified by using PCR，then the nucleotide sequence of two genes were analysed.Results Some strains stably resistant to tetracycline were obtained from 2 of 10 test strains，the MICs of these laboratory resistant strains were 16128g/ml.with 16-fold512-fold increase when compared with parental s

7、trains (MIC 0.25g/ml、2g/ml， respectively). The gene of tetL was detected in the plasmid DNA of one test strain and its laboratory resistant strains. The gene of tetM was detected in the chromosome DNA of the laboratory resistant strains from another one test strain. Some strains stably resistant to

8、levofloxacin were obtained from 2 of 10 test strains.The MICs of the laboratory stains were 1664g/ml，with 832 times higher than that of the parental strains (MIC 2g/ml、2g/ml respectively). Neucleotide sequence analysis and comparison of the derived amino acid sequence revealed that GyrA had a substi

9、tution at position 83 and 87 in laboratory resistant strains.The alterations in ParC at position 80 were observed in all laboratory resistant strains.Conclusion The results of in vitro experiments on enterococcal strains for induced resistance to tetracycline and levofloxacin，which were performed by

10、 one-step method，show that acquired resistance could be occurred when exposuring them to high level of some antibacterial agents for short term.     【Key words】 enterococcus antibacterial agents induced resistance antibacterial pressure    近年来，肠球菌作为一种引起医院感染的重要

11、病原菌已经引起了医学界的广泛关注。美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为引起医院感染的第二大病原菌1。    肠球菌不仅具有天然耐药性，而且更易被诱导产生新的耐药性。Tankovic报告对环丙沙星耐药的肠球菌由19871989年期间的不到2%增加到19911993年间的14%以上，而且是由该类药物在临床上的应用增加所致2。在瑞典Huddinge医院，对喹诺酮耐药的肠球菌由1994年的11%增加到1997年的25%3。而国内19972001年期间临床分离的肠球菌对环丙沙星耐药率分别为粪肠球菌44.2%，屎肠球菌70.7%4。在美国，由于万古霉素的使用，

12、19891993年间肠球菌对万古霉素的耐药率增加了20倍。这些统计学临床资料已经显示，抗菌药物的临床应用造成的药物选择性压力可能是引起肠球菌耐药性的产生与扩散的重要原因之一。    为深入探索肠球菌耐药性的产生和发展，本课题就此进行了部分抗菌药物的实验研究。    1 材料与方法    1.1 材料    1.2 方法    2 结果    2.1 四环素诱

13、导性耐药试验结果    表1 四环素诱导的菌株的耐药性注：TE521、TE522、TE821、TE822分别为实验菌株TE5和TE8的48h诱导耐药株；TE531、TE831、TE532、TE832分别为实验菌株TE5和TE8的72h诱导耐药株。     2.2 左氧氟沙星诱导耐药性试验结果    表2 左氧氟沙星诱导的菌株的耐药性注：LE121、LE131、LE141分别为实验菌株LE1在48h、72h和96h诱导培养后生长的菌株；LE521、LE531、LE541分别为实

14、验菌株LE5在48h、72h和96h诱导培养后生长的菌株。    表3 左氧氟沙星诱导的耐药菌株的gyrA序列改变        表4 左氧氟沙星诱导的耐药菌株的parC序列改变3 讨论     在一步法抗菌药物诱导性耐药试验中，分别接种了1×107CFU实验菌于含高于耐药MIC浓度的左氧氟沙星BHI琼脂平板和四环素BHI琼脂平板上，实验菌株在24h培养后均无肉眼可见的菌落生长，表明肠球菌对左氧氟沙星和四环素耐药菌株的自发突变

15、率一般低于1×10-7。48h后诱导生长的菌株再次接种含抗菌药物BHI琼脂平板，则于24h培养后生长成菌膜，表明为非缓慢生长的肠球菌。实验菌株和ATCC29212接种在35已预先放置了24120h的含抗菌药物BHI琼脂平板上，培养24h后无菌落生长，示诱导生长的菌株不是因为培养基中的抗菌药物活性下降所致。药物敏感性测定结果表明诱导后生长的菌株均单独对左氧氟沙星或四环素耐药。以上结果表明分别在含左氧氟沙星或四环素的BHI琼脂平板上，于48h后生长的菌株均应为药物诱导产生的耐药菌株。    肠球菌对喹诺酮类药物耐药的主要机制是由于DNA促旋酶A亚单

16、位（gyrA）和拓扑异构酶（parC）基因突变引起。一般认为parC为肠球菌对喹诺酮类药物耐药的第一突变基因，低中水平耐药一般仅有parC突变，高水平耐药常既有parC突变，又有gyrA的突变，尚未发现仅有gyrA突变而无parC突变的肠球菌耐药菌株。本实验中诱导的耐药株未见gyrA编码的蛋白质QRDR内的第83和87位氨基酸，或parC 编码的蛋白质QRDR内的第80和84位氨基酸同时发生改变的诱导耐药株。此结果与文献报道类似7。    肠球菌对四环素的主要耐药机制为产生外排蛋白和核糖体保护因子，其中最主要、最常见的2种耐药决定子为tetL、tetM。本实验诱导的四环素耐药株的PCR扩增结果显示，TE8实验株的诱导耐药株全部含有tetM耐药决定子，而未检测到tetL耐药确定子。TE5实验株及其诱导耐药株全部检测到tetL，而未检测到tetM。TE5实验株为四环素敏感菌株，其MIC为0.25g/ml，但在其质粒中检测到tetL耐药决定子，此种基因型和耐药表型不一致的现象尚未见报道。推测可能为某种因素抑制了tetL的表达，经四环素作用后，解除了对tetL表达的抑制，进而对四环素产生耐药。    本研究中对诱导的耐药菌株