分子生物学硕士生复习题张

1、1 阐述基因概念和你对基因定义的了解。基因是指定产生一条多肽链的一段DNA，它包括位于编码区前后的前导序列和后随序列，以及处在两个编码片段之间的间隔序列。-Genes VIII基因被定义为功能单位是在发现单个基因负责产生特定的蛋白质之后。基因的DNA及其多肽链产物在化学性质上的差别，导致了“一个基因编码一种蛋白质”的概念产生，因此我们得更严谨的来定义基因，在许多情况下，基因是编码一段RNA的一段DNA序列。2 举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和四级结构。蛋白质二级结构: 一条多肽链主链原子局部的空间排列。蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象。如-

2、螺旋、片层、转角和无规卷曲等。超二级结构（MOTIF）：在蛋白质分子中特别是在球状蛋白质分子中经常可以看到由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。3种基本组合形式：，和。Domain结构域：多肽链中一些连续的或不连续的氨基酸，在二级结构或超二级结构的基础上进一步组装成三级结构的局部折叠区，形成可被特定分子识别和具有特定功能的三级结构元件。它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域。如红细胞凝集素含有一个球状和一个纤维状的结构域。三级结构：一条肽链的所有原子的空间排列。三级结构是在二级结构的基础上由疏水

3、作用和侧链相互作用形成的。如肌红蛋白的三级结构有8段-螺旋区每个-螺旋区含724个氨基酸残基，有18个螺旋间区肽链拐角处为非螺旋区（亦称螺旋间区），包括N端有2个氨基酸残基，C端有5个氨基酸残基的非螺旋区内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中。四级结构：几个亚基在三级结构的基础上相互作用所形成的空间结构。如血红蛋白是由4个亚基聚合而成的，4个亚基两两相同，即含两个亚基和两个亚基。在一定条件下，这种蛋白质分子可以解聚成单个亚基，亚基在聚合或解聚时对某些蛋白质具有调节活性的作用。3 解释大肠杆菌DNA复制的基本过程。E.coli只有一个复制起始位点，由245bp组成，在大多数细菌中高度保守，其D

4、NA复制其实阶段需要在引发体作用下合成RNA引物。起始：<1>. 在Hu蛋白，INF协助下，DnaA蛋白四聚体在ATP参与下通过消耗ATP，结合于OriC的9bp重复序列，这种结合具有协同性，能使20-40个DnaA在较短时间内结合到OriC附近的DNA上。<2>. DnaA蛋白组装成蛋白核心，DNA环绕其上。<3>. DnaA水解ATP驱动TATA box序列解链，形成长约45bp的开放起始复合物。<4>. 在DnaC和DnaTA的协助下，两个DnaB被招募到解链区。<5>. 在DnaB作用下，OriC内接恋曲不断扩大，形成复制泡，

5、SSB结合于单链DNA上，期间解旋形成张力由TOP II消除。延伸：<1>. 在PriA，PriB和PriC的协助下，DnaG被招募到两个复制叉上与DnaB结合，DnaA脱离复合物。<2>. DnaG沿着DNA模板链合成前导链的RNA引物。<3>. DnaG沿着DNA模板链合成后随链的RNA引物。<4>. DNA Pol III结合到两个复制叉上。<5>. 由DNA Pol III分别合成前导链和后随链。终止：E.coli顺时针复制叉有4个连续排列的称作终止子的序列，逆时针复制叉有3个连续排列终止子。当复制叉移动到终止子处，被称作终点

6、利用物质的蛋白结合在Ter序列上，阻值复制叉移动。当两个复制叉相遇，则完成整个DNA复制。复制完成后两个子代分子需由TOP IV将其中一个环切开，使两个子代分子分离之后再由连接酶连接成环。4 DNA聚合酶III各亚基的功能。DNA聚合酶III是一个900kDa的复合体，它包括10个蛋白质，组成4个亚复合体，包括：² 有两份拷贝的催化核心，每个催化核心包括亚基(DNA聚合酶)、亚基(3-5核酸外切酶校正活性)、和亚基(刺激核酸外切酶)² 有两份拷贝的二聚化亚基，它将两个催化核心连接在一起，维持二聚体² 复合体由5个蛋白质组成，而夹钳组装机使具有前进动力的亚基结合到D

7、NA上5 阐明Rolling Circle Replication。在以这种机制进行的复制中，亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'端游离出来。这样，DNA聚合酶III便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5'端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环复制。由于只有一条DNA链是完整的，因而在DNA解链时不会产生拓扑学上的问题，即未解

8、链的双螺旋区不会产生超螺旋。在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态。6 阐明端粒结构与端粒酶的功能。端粒的结构：端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，是由端粒DNA和与端粒DNA特异结合的端粒结合蛋白组成的核糖核酸的蛋白质复合物，不同的真核细胞端粒存在类似的DNA序列与结构，且高度保守。富含G，而且富含G的链(53)比富含C的链(35)突出1416个核苷酸，并在末端形成一个DNA襻，使

9、其末端不存在任何游离的结构，以保证其稳定性，该结构的形成由TRF2催化。端粒除简单的核苷酸重复外，还包含有特殊的非核小体蛋白端粒结合蛋白端粒结合蛋白依据结合特性分为两大类 (1) 双链TBPs (double-strand TBPs)：这是一类可特异地与双链端粒重复序列结合的蛋白质，它在端粒长度的维持中具有重要作用，而且对端粒具有保护和调节功能。 (2) 单链TBPs(single-strand TBPs)：可结合于3单链突出的末端，对于染色体末端的“戴帽”，以及端粒酶活性的调节具重要作用。端粒酶的功能：端粒酶的主要作用是维持端粒的长度。端粒酶不但可以维持已经存在的端粒DNA，同时端粒酶反转录

10、酶能够识别断裂染色体的末端，重新将端粒重复序列加到染色体的断裂末端或非端粒DNA上。端粒酶能利用端粒3端单链为引物，自身的RNA为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度。另外，端粒酶能保护染色体末端，任何一种别的末端结构7 阐述原核生物DNA修复机制（举3例）。错配修复直接修复切除修复重组修复应急反应（SOS）8 阐述DNA重组中相关的重要蛋白质。了解重组中许多蛋白质的结构和生化功能有助于我们深入理解重组的机制，其中有许多重要的蛋白质如RecA,RecBCD, RuvA, RuvB 和RuvC.RecA蛋白RecBCD酶的三个亚基分别由基因recB,recC,recD编码，它

11、具有5种酶活性：a. 核酸外切酶活性；结合在双链DNA的断裂处，同时降解两条链；b. 解旋酶活性：其解旋的速度比形成螺旋的速度快，当沿着DNA分子前进时，能形成单链DNA环；c.核酸内切酶活性；d.ATP酶活性；e.ssDNA核酸外切酶活性。9 阐述易位因子概念和反转录病毒复制机制。易位因子：（1）定义：易位因子又称转座子或跳跃基因是一类DNA序列，它们能够在基因组中转录和逆转录，或在内切酶的作用下，在其他基因座上出现。易位因子的这种行为，与假基因的出现颇有相似甚至相同之处。（2）种类：真核生物中根据转座子“跳跃”方式的不同分为I型和II型转座子。a、I型转座子转座中间体是RNA。该型转座子先

12、被转录为RNA，再经转录成为DNA，才被插入到目标位点中。b、II型转座中间体是DNA。该类型转座子在结构上有其特点，其两端是两段直接重复序列，随后连接的是反向重复序列，中间为插入序列。细菌的转座子有两类：a.插入序列（IS），是简单的转座子，出专做所需基因外不携带任何标记基因。b.复杂转座子（Tn），除转座酶基因外还携带有各种标记基因。10 原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么？启动子保守序列有：在起点上游约-35位置，找到以保守序列：TTGACA，称为识别区或-35序列。在-10处找到6 bp的保守序列：TATAAT，称为Pribnow box，或-10序列。这两个序列是R

13、NA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。在-35区和-10区之间的距离17±1 bp。保持启动子这二段序列及它们之间的距离是很重要的。终止子：提供转录停止信号的DNA序列。所有的原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结构，其产生的RNA可形成茎环构成的发夹结构。大肠杆菌中有两类终止子：不依赖的终止子（简单终止子）和依赖的终止子。简单终止子除能形成发夹结构外，在终点前还有一段由6-8个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U，另外回文对称区通常有一段富含G-C的序列。依赖的终止子必须在因子存在时才发生终止作用，回文区无富含G-C，也无寡聚U。11 RNA聚合

14、酶I识别的启动子包含有哪两个部分？分别有什么蛋白因子识别？RNA聚合酶只转录编码核糖体RNA的基因，转录产物经切割和加工后生成各种成熟rRNA.RNA聚合酶I 的转录单位有两段起始调控序列，核心启动子(Core promoter)和上游启动元件upstream promoter element(UPE) 核心启动子(Core promoter)位于起始位点周围，从-45 延伸到+20，它本身就足以起始转录。但是，其效率可被位于-180 到-107 的上游启动元件（UPE)显著提高。与一般启动子相比，这两个区域都有不寻常的组成，富含GC碱基对，而且它们约有85%是一致的。RNA 聚合酶需要上游元

15、件结合因子(UBF1)和选择因子（SL1）两个辅助因子。UBF1 是一个单链多肽，它先后与UPE和核心启动子上富含GC 区结合。SL1 因子是一个四聚体蛋白，其作用类似于原核生物因子，本身对于启动子没有特异性，但一旦UBF1 结合，SL1 就可以协同UPE结合到此覆盖的DNA 延伸区域，可能其主要功能是使RNA 聚合酶正确的定位在起始位点。发生在两个部位的结合因子之间相互作用的详细情况尚不清楚。12 RNA聚合酶III识别的启动子有哪几类？其定位因子是什么？类型 I由boxA序列和一个隔开的 boxC序列组成，类型 II由 boxA和一个隔开的 boxB序列组成。类型 II启动子上的 A盒和

16、B 盒之间的距离可以变化很大，但两盒不能过近，太近会失去其功能。我们将在稍后讨论其上游类型的组织结构。类型III被分隔的启动子序列在起始位点上游，有三个上游元件:OctPSETATA。RNA 聚合酶在上游启动子的起始可在紧靠起始位点上游的一段短区域内发生，而且该区域只包含 TATA元件。然而，如果具有 PSE(近端序列元件)和 OCT元件，转录的效率会大大提高。这些元件的结合因子能够起互相协调作用。RNA聚合酶 III 通过内部启动子起始转录过程中，包含着 TFIIIA、TFIIIC、TFIIIB 以及聚合酶的依次组装，。TFA和TFC是装配因子，其作用是帮助TFB结合在正确的位置。TFB 是

17、 RNA 聚合酶所需要的真正的起始因子，负责 RNA聚合酶的正确定位。在类型 I启动子，TFA结合一个包括 boxC的序列，而且该结合是 TFC 结合所需要的，TFC 的结合又引发 TFB 与起始位点周围的一个序列结合。在类型 II 启动子，TFC 识别 boxB，但结合在一个更大的区域包括 boxA 和boxB，然后招募TFB结合。对于上游启动子的第 III 类启动子，TATA元件被一个包含 TBP的因子识别，多种转录因子直接识别上游位点形成前起始复合体(包括 TBP)，此复合体被 RNA 聚合酶所识别。13 RNA聚合酶II识别的启动子含有多种顺式作用因子，请举4例。RNA聚合酶II启动子

18、涉及众多编码蛋白质基因表达的控制，该类型启动子包含四类控制元件：基本启动子、起始子、上游元件和应答元件。这些元件的不同组合，再加上其它序列的变化，构成了数量十分庞大的各种启动子。它们受相应转录因子的识别和作用。eg1: TATA box通常位于起始位点上游约25bp处的7bp保守区，它组成唯一的上游启动子元件，此元件距起始位点有相对固定的位置，具有定位转录起始的功能。它可以在所有真核生物中找到。TATA盒倾向于被富含G*C对的序列环绕，可能是TATA盒起作用的一个因子。具有选择定位转录点的功能，作为定位因子起作用的eg2: GC box通常在起始位点上游40-70bp处，但在每一个启动子中，G

19、C盒前后的情况是不一样的。功能是加强转录，两个方向都有效。eg3: CAAT box约在-75bp处，决定了转录的效率，两个方向都有效。eg4: 核苷酸八聚体（Oct,8bp长的序列元件）能增强真核生物启动子的转录功能。14 如何实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达。首先，要构建有效的表达载体，一般可以在目的基因上游加上乳糖操纵子，通过培养的时候先扩增生物量，再诱导产物形成的可调控型表达；提高表达录水平：（1）选择作用性强、可严紧调节的启动子、正确的阅读框及不依赖Rho因子的终止子（2）一位于翻译起始密码子5端大约9bp的SD序列（3）使mRNA形成二级结构的可能性

20、最小。（4）提高mRNA稳定性：在E.coli中有两类保护性元件能够稳定mRNA。一类由mRNA的5UTRs中的序列组成；另一类由3UTRs和多顺反子间区的发卡结构组成。（3）选用缺乏某些特定RNase的宿主菌来提高基因的表达（4）通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃，在E.coli中偏向于使用UAA密码子。（5）选用蛋白酶缺陷的菌株，以防止蛋白质的蛋白酶解（6）构建N-末端或C-末端融合蛋白；融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白（7）与分子伴侣共表达（9）优化培养条件，E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提。提高蛋白分泌：（1）在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄

21、球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因共表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。（2）对培养基的特殊操作。如，添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解。15 请阐述RNA SPLICING的基本过程。16 请阐述核酶概念及应用的研究进展。核酶(ribozyme)是一类具有催化活性的RNA 分子,可通过碱基配对特异地与相应的RNA 底物结合,并在特定的位点切割底物RNA 分子。核酶的种类很多，从结构上看主要有发夹状核酶(hairpin ribozyme)和锤头状核酶(hammerh

22、ead ribozyme)。目前，核酶主要用于基因治疗上。即将核酶基因导入细胞内，使其在细胞内表达出相应的核酶，从而对mRNA进行切割，在翻译水平阻止某些基因的异常表达，达到治疗疾病的目的。1核酶在肿瘤治疗中的应用核酶与癌基因：切割目的基因的，阻断癌基因的表达，诱导其分化和凋亡。核酶与多药耐药性：设计核酶抑制耐药相关基因的表达，使耐药的肿瘤细胞重新获得对化疗药物的敏感性。核酶和端粒酶：应用核酶技术通过抑制端粒酶活性, 从而抑制肿瘤细胞的增殖。2核酶在抗病毒中的应用抗艾滋病病毒HIV：利用特异性核酶在细胞内抑制HIV-1的LTR mRNA表达，降低细胞HIV-1病毒蛋白的表达水平。抗乙肝病毒HB

23、V：核酶能特异地切割HBV前基因组RNA , 使其丧失模板尽管核酶已经开始应用于人体内治疗,但尚有许多问题有待解决。例如:如何获得高效、无毒的特异性核酶,如何选择靶序列中最佳切割位点,如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等。17 请阐述Aminoacyl tRNA synthetases 在蛋白质翻译中的作用。在蛋白质翻译中，每种tRNA分子在它到达核糖体之前都需与相应的氨基酸结合，这种结合是在一系列被称为氨酰-tRNA合成酶作用下完成的。大多数细胞可产生二十种不同的氨酰-tRNA合成酶，每一种酶既识别tRNA，又能识别氨基酸，对两者都具有高度专一性。它们各不相同，各负其责，使一种氨基酸

24、与其相应的一套tRNA分子结合。这些酶可以将正确的氨基酸装载到相应的tRNA分子上，于是，tRNA就可以执行它从DNA的脱氧核糖核苷酸序列信息到蛋白质的氨基酸序列信息的翻译功能，保证了蛋白质翻译的真实性。1.氨酰 tRNA 合成酶正确识别相应 tRNA 并使其氨酰化的机制 , 可维护翻译的精确性，是中心法则的重要保障.2.每种氨基酸都被一种特定的氨酰-tRNA合成酶识别，而后者可识别所有能携带这种氨基酸的tRNA。氨酰-tRNA合成酶有校对功能，可检验合成的氨酰-tRNA，水解非正确的氨酰-tRNA。合成酶在识别tRNA 和氨基酸时都使用了校对机制。 18 在翻译水平上解释为何真核生物通常具有

25、单顺反子结构，而原核生物却具有较多的多顺反子结构。原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子。真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子。1从翻译机制来讲，首先，原核生物是属于转录共翻译，mRNA存在半衰期很短，需要快速利用它翻译蛋白质，而真核生物是转录之后，进行一系列的mRNA加工，再将成熟的mRNA运输到核外翻译，因此原核生物选择多顺反子有利于蛋白质高效快速表达，而真核生物单顺反子有利于蛋白表达的精准调控。 2从适应环境来讲，在不稳定环境中生活的原核生物，原核生物要能活下来必须在生理上能够适应环境或调节细胞活性来适应改变了的条件。环境

26、因子影响下，原核生物必需快速开启或关闭某些基因的表达来适应环境条件（主要是营养水平的变化）。而真核生物更重要的是实行基因表达的精准调控，要求其在特定的时间特定的条件下表达特定的基因产物，而当mRNA上有多个核糖体存在时，第一个顺反子的翻译会影响mRNA的空间构象，从而影响其基因表达的精准调控。19 分析大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控机制乳糖操纵子的结构 大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因。基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序

27、列、O序列和CRP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。（1） CRP的正性调节：分解代谢物基因激活蛋白 CRP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CRP结合，这时CRP结合在乳糖启动序列附近的CRP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CRP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。（2）阻遏蛋白的负性调节：在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，基因列在P启动序列操纵下表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻

28、遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子半乳糖苷酶、透酶生成。当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数 -半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。20 解释大肠杆菌色氨酸操纵子的调控机制。阻遏机制：当环境trp水平高时，trpR表达的阻遏蛋白R与色氨酸产生复合构想变化而活化，与trpO特异性紧密结合，转录受阻遏。当环境trp水平低时，R的无活性的形式存在，不

29、能与trpO结合，对转录起阻遏作用。衰减机制：当trp达到一定水平，但还没高到能活化R使其产生阻遏作用的程度时，系统倾向于精密调节，产生trp合成的酶类的量已经明显降低。Trp操纵子有两个其他的区域，分别是LP和a，有一段162bp的序列，称前导RNA，编码14个氨基酸的多肽，即前导多肽；两个trp密码子位于前导多肽中第10和第11的位置；前导RNA有4段能相互配对的碱基序列。通常在被翻译的密码子后，翻译核糖体与mRNA中大约10个碱基接触。因此，当前导区最后的密码子被翻译时，核糖体部分覆盖片段1和片段2，所以没有碱基配对。回想一下，在偶联的转录-翻译系统中，前导核糖体位于聚合酶后不远处。因此，当RNA聚合酶正在完成片段4的合成时，如果核糖体接触片段2，那么没有片段2竞争片段3，片段3和片段4就能形成3-3茎环构象。当达到7个尿嘧啶核苷酸组成的终止序列时，3-4茎环构象的存在使终止产生。如果存在的trp非常少，负载的tRNAtrp的浓度变得不