亲和膜分离技术及其在生物产品分离纯化中的应用研究进展

1、亲和膜分离技术及其在生物产品分离纯化中的应用研究进展（贵州大学化学与化工学院，贵州，贵阳，550003）摘 要亲和膜分离技术是一项新兴的技术，兼有膜分离和亲和色谱的优点，可以有效地进行生物产品的分离和纯化.本文介绍了亲和膜的制备及其分离工艺、国内外亲和膜在生物产品分离纯化中的研究进展, 并指出了存在问题和展望，为我国亲和膜的发展提出研究方向。关键词亲和膜；生物产品；分离纯化The Technology of Affinity Membrane Separation and its Development in Separation and Purification of Biological

2、Product(School of Chemstry and Chemcial Engeering,Guizhou University,Guiyang,Guizhou,550003)AbstractAffinity membrane separation, as a new technology, has advantages of both membrane separation and affinity chromatography,and is good for the separation and purification of biological products.The pre

3、paration of affinity chromatography and separation technology are introduced in this paper.At the same time, development of application in separation and purification of biological products are is summarized.Then the application of affinity membrane separation in in separation and purification of bi

4、ological products is put forward, it points out the existing problems currently and future development trends.key wordsAffinity membrane;biological product;separation and purification1.引言随着生物工程和生命科学的迅速发展, 对生物大分子分离纯化的要求越来越苛刻。为获得高纯度、高质量、低成本的生物产品,突破传统的分离方法，寻找一种既经济又有效的新型分离途径已成为迫切需要。在传统的研究中，膜分离和亲和分离是2个平行

5、发展的研究方向，在生物分子的分离和纯化方面各具特色，但也存在着一些不可克服的技术缺陷。膜分离过程设备简单，易于放大，成本低，分离速度快，可连续操作；而亲和分离的选择性和特异性较强。由膜与亲和分离相结合的亲和膜分离技术，可发挥两者的特色，具有处理量大、选择性强、易于放大等显著优点。亲和膜技术的研究始于20世纪中期，自1991年Klein1的亲和膜( Affinity Membrane)专著出版以来，促进了对亲和膜技术的研究，在基膜材料改性、亲和配基偶联、亲和膜组件设计、过程动力学以及亲和膜应用方面都有了较大的发展，但还有许多问题有待进一步深入研究。目前，亲和膜分离技术已被广泛应用于干扰素、单克隆

6、和多克隆抗体、胰蛋白酶及其抑制剂、白蛋白、纤维蛋白等多种生物医药制品的分离纯化之中2-5。2.亲和膜的制备亲和膜分离的原理主要是基于膜上的配基与混合物中目标分子间特异性吸附能力的强弱与大小差异。亲和膜的优劣可从几点评判6：1. 是否有足够的表面积和适当的孔径与可接受的孔径分布；2.膜表面是否有足够多的可使其活化并偶联间隔臂和配基的基团(一般为-OH，-NH2，-SH或-COOH基)；3.膜的承压和抗形变能力；4.耐酸碱、耐高浓度盐和有机溶剂的性能等。2.1.亲和基膜材料亲和膜基质材料按来源大致可为天然和合成聚合物。常用的有：聚烯烃类(聚乙烯、聚丙烯)，芳香聚合物(聚碳酸酯、聚矾、聚醚矾)，酯族

7、聚酰胺(尼龙6、尼龙66)，以及聚乙二醇(PEG)、纤维素等特殊聚合物。目前研究较多的是纤维素、聚(丙烯)酰胺及其衍生物、化学改性聚枫、还原聚羟乙基甲基丙烯酸酯(PHEMA)、甘油基甲基丙烯酸醋与乙二醇二甲基丙烯酸酷共聚物，无机膜如玻璃中空纤维膜等。膜材料一般要加以改性，以改善膜的亲水性能，减少非特特异性吸附位点，增加可化学反应的基团。膜孔结构、孔径分布等对膜的改性有较大的影响。2.2.亲和配基亲和膜的分离作用主要取决于配基与目标物的特异性结合，从整体来说，亲和配基可分为特异型配基和通用型配基两大类。特异型配基具有高度的专一性，只与特定的生物分子相结合，例如酶与它们的底物或抑制剂，特异性抗原与

8、抗体，细胞受体与调节剂等。此类配基有着很好的发展前景，既可用于纯化生产又可用于分子水平上对生物体进行科学研究，但是现阶段由于制备和提取上的困难，其研究还处在初级阶段。通用型配基也称基团配基，该类配基以某种基团为靶目标，可与含有某特定基团的目标物发生亲和作用。现阶段亲和膜研究中多采用此类配基，具有容量高，费用低等优点，其特异性较差的缺点可通过改善吸附和脱附条件进行补偿。通常所使用的通用型配基一般来说是简单的小分子如氨基酸，染料，金属离子等，近来一些大分子配基如壳聚糖、多肽、蛋白质、多粘菌素等也正得到越来越多的应用。配基作为亲和膜特异性分离能力的核心来源，是亲和膜制备中的首要考虑因素。配基的选择首

9、先要考虑其与待分离物质的亲和作用力。要强弱适中，即形成的亲和复合物的解离常数(Kd)既不宜太高，也不宜太低。若Kd太低，则二者结合过于牢固，吸附过程几乎不可逆，造成洗脱困难。若太高则配基的选择性不佳。一般选择Kd在10-4-10-2为宜7。配基分子还必须含有可以与活化载体反应并与之连接的化学基团，这些基团应不参与配基与目标物之间的特异结合，并不会对配基与目标物之间的亲和力造成影响。2.3.亲和间隔臂不少生物分子的直径较大，在亲和吸附过程中常会受到分子空间位置效应的影响，通过在膜与亲和配基之间联接一个间隔臂能消除这种影响。间隔臂分子一般采用烃类、聚胺类、多肽、以及聚醚类等直链分子。是否使用间隔臂

10、依赖于配基、样品、活化方法。间隔臂的作用是使配基远离基质，从而使生物大分子易接近配基的活性位点。间隔臂过长或过短都不好，间隔臂分子过长时由于压力扭曲会通过封闭膜上相邻活性位点而引起空间位阻，过短则不利于配基与目标物质的接触反应。间隔臂的适宜长度可通过实验确定，通常以3-6个碳链为宜。2.4.亲和膜的制备方法 亲和膜的制备主要通过载体活化与配基偶联二步实现8。 (1)载体活化。即通过适当的化学反应，在表面接上可反应的官能团或者是一定长度的间隔臂。一些脂族烃类膜的机械强度和化学稳定性好，但往往没有活性的侧链或末端基团，需要通过化学处理、共聚、共混、等离子体处理等方法对其表面或内孔进行活化改性，引入

11、所需的化学基团；芳香族共聚物和酰胺类都有末端官能团，通过活化以与配体连接；纤维素材料本身带有大量可利用活性基团的材料，需通过改性以提高其强度和稳定性。(2)配基偶联。配基的偶联目前大多采用化学方法，有溴化氰法、环氧法、羰基二咪唑法、高碘酸盐法、取代磺酰盐法、碳二亚胺法、混合酸酐法、金属鳌合法等，其中以环氧法用的较多。亲和膜的制备可以在成膜前或成膜后实现。成膜前法是先制备成带有配基的亲和材料，然后通过纺制或涂层等方法制成相应形状的亲和膜；成膜后法是先制成平面膜或中空纤维膜后，再通过对膜的表面或内孔活化与偶联制得。如通过将活化试剂用泵压入中空纤维膜组件中，使其表面产生活性基团，然后再将用作配基的酶

12、或蛋白溶剂与膜上活性基团相偶联，制成亲和膜。2.5.亲和膜组件 亲和膜组件大致可分为平膜式和中空纤维膜式二种，其中平膜式有板框式和圆盘式之分。平膜式可将膜片一层层叠加起来，组成膜堆或膜柱，其优点是自上而下比较均一，结构简单，成本低，缺点是单位体积内所占的膜面积小，放大时操作压降较大。中空纤维亲和膜单位体积内的面积大，放大时可通过增加纤维数来实现，不会增加操作压降，便于实现连续、自动、规模化操作。中空纤维亲和膜的主要缺点是由于在膜管轴向与径向上存在流速分布，流速不同会导致亲和吸附的不均匀。3.膜分离过程工艺 亲和膜分离过程的主要分为二类：亲和过滤和亲和膜分离9。亲和过滤包括亲和微滤与亲和超滤，亲

13、和超(微)滤过程实际上是亲和吸附与错流超(微)滤相结合的工艺过程。亲和载体在膜上游混合物中与有关目标生物分子相结合，生成配基和配合体为一体的复合物，其余不和膜上配基产生亲和作用的物质则随流动相通过膜流走。然后改变条件，如洗脱液的组成、pH值、离子强度、温度等，使复合物产生解离。接着，用有关缓冲液将生物分子从载体上脱附下来，再经过膜过滤获得所需的产品。亲和载体再生后返回吸附槽，膜在过程中仅起着过滤作用，达到目标分子的提取与浓缩的目的。有三种方法将亲和吸附在配体上的蛋白脱附下来。第一种为可溶反向配体法，采用一种能与吸附在亲和膜上的大分子作用并结合的配基，将膜上的大分子洗脱下来，然后再将此配基分离；

14、第二种方法为配体交换法，用一种与吸附蛋白竞争性结合的溶质洗脱，特异性地将吸附的不同蛋白分别洗脱下来，这类竞争性溶质包括含-NH2、-COOH、-SH等基团的物质和咪哇等取代剂。第三种方法为变形缓冲液法，用一种能使大分子产生形变的缓冲液进行洗脱，将吸附在膜上的大分子脱附下来。4. 亲和膜分离技术在生物产品分离纯化中的应用研究进展 亲和膜是以共价键将具有生物活性的配位体（如酶、辅酶、抗体、激素等）结合到不溶性固体支持物或基质上作固定相，利用蛋白质或大分子与配位体之间特异的亲和力进行分离的液相色谱法。它主要用于蛋白质和各种生物活性物质的分离和纯化10。根据蛋白质与配基的不同，可将亲和膜分为生物亲和色

15、谱膜、免疫亲和色谱膜、金属离子亲和色谱膜等几大类。利用不同配基螯合而成的亲和膜，是分离纯化生物大分子的有效方法，它具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性和通用性较好，易于放大等优点。4.1.金属离子亲和色谱膜固定化金属螯合色谱膜是一种有效的蛋白质分离纯化方法，其原理是通过Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸、色氨酸或半胱氨酸配位结合，利用蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象的不同所导致的与金属螯合物的亲和力的大小的不同，选择性地对蛋白质加以分离纯化11-13。 秦晓蓉等14也用固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白(Hb)，考察了血红蛋白浓度、

16、pH值、离子强度、温度和时间对吸附的影响。结果表明，固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白的最大吸附量为14.8719 mg/g，当控制温度16-25、pH值7.0-7.4、Hb浓度0.8484-1.2726 mg/mL时，吸附效果较好；离子强度越低，吸附效果越好；吸附时间至少为30 min。该固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白的研究为实际体系的分离研究奠定了基础。该团队还将纤维素滤纸进行碱处理及环氧活化、偶联亚氨基二乙酸、固定化铜离子等处理，并将其装入自制的色谱柱管，制得固定化铜离子亲和膜色谱柱。该柱可用于吸附血红蛋白( hemoglobin, Hb)，吸附率可达到 90%以上。考察了上样量、p

17、H值、温度、上样速度等因素对固定化铜离子亲和膜吸附 Hb的影响。实验结果表明，固定化铜离子亲和膜色谱柱吸附血红蛋白的最佳条件为：室温下实验,缓冲体系的 pH值控制在6-8，上样速度0.5-1.0mL/min，上样量为3.16-7.90 mg/g15。 张亚辉等16以纤维素滤纸为载体，通过环氧氯丙烷交联活化、亚氨基二乙酸偶联、金属离子螯合制备得到亲和膜。应用该膜进行的蛋清蛋白纯化试验结果表明，Cu2+亲和膜具有较好的吸附性能和纯化效果，只需采用两步洗脱的方式即可得到具有明显纯化效果的蛋清转铁蛋白和溶菌酶。鲍时翔等17将纤维素滤纸经碱处理环氧活化、偶联 IDA、固定化Cu2+ 后制得大孔纤维素亲和

18、膜。以BSA为目标蛋白研究亲和膜吸附蛋白质的性能，对亲和膜的流速与负压、亲和膜性能的稳定性进行考察，并对解决金属离子泄露问题进行探讨。结果表明，采用普通纤维素滤纸可以制成性能优良的亲和膜，并有望在大规模蛋白质分离纯化上得到应用。李静等18采用亚氨二乙酸(IDA)-Cu2+亲和膜分离新工艺，分离纯化混合酶和蛋壳中的溶菌酶，实验结果表明，亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好，对葡萄糖氧化酶基本不吸附；用亲和膜直接从蛋清(壳)中分离提纯溶菌酶，通过正交实验，找出了最佳操作条件，在此条件下提取的溶菌酶纯度大于17500 U/mg。聂志妍等19别用固定化金属亲和层析胶Cu2+柱、Ni2+柱、固定化金属亲和层

19、析膜Cu2+柱、Ni2+柱分离纯化rhCu,Zn-SOD、rhMn-SOD/24a、rhMn-SOD/28，比较了固定化金属亲和层析膜与亲和层析胶的纯化效果。结果表明，亲和胶与亲和膜分离SOD获得相似的纯化效果，纯化倍数均在3-5之间，亲和膜分离所得SOD比活略高于亲和胶，rhCu,Zn-SOD与Cu2+的亲和能力高于rhMn-SOD。由此看出固定化金属亲和层析膜色谱为基因工程产物的快速分离鉴定提供了一个简便的方法。 柴红等20采用自制的等离子体引发聚合装置，在微孔聚丙烯膜表面接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯，再通过亚氨二乙酸钠( IDA)偶联和铜离子螯合，制备了固定铜离子亲和膜。考察了等离子体放电条

20、件、单体浓度和接枝时间对接枝率的影响, 用红外光谱和X射线光电子能谱表征了处理前后膜结构的变化，并用制得的亲和膜进行牛血清蛋白( BSA) 的吸附研究。结果表明，最佳接枝条件为放电时间30 s、放电功率10 W、GMA单体浓度1 mol/L、接枝时间30h。在此条件下，接枝率最大可达13.28%。在接枝率为 11.86%的膜上，IDA-Cu2+的浓度为0. 013 mol/( kg干膜)。经过酸处理后的膜，大大降低了对 BSA的非选择性吸附。亲和膜吸附能力随接枝率的上升而增加。4.2.免疫亲和膜免疫亲和膜是基于抗原和抗体间快速、高特异性可逆的结合作用，将抗体或抗原固定到膜材料表面，用于互补免疫

21、物质的有效分离和纯化的一种新型分离技术。与常规的亲和膜相比，免疫亲和膜具有更高的分离选择特异性，其分离纯化的蛋白质纯度均高于90%21。将抗体或抗原固定到膜材料表面，制成免疫亲和膜 ( immuno-affinity membrane, IAM)，可用于高效选择性地从复杂的生物、药物、食品或环境等样品中分离得到所需的微量目标化合物或研究抗体与小分子间作用力的大小3抗原-抗体相互作用的基础是分子互补的空间化学结构 ,其中涉及静电相互作用、范德华力、疏水作用力、 氢键作用以及空间大小和形状的匹配等多种因素，而非单一的物理化学作用，因此在识别的选择性和结合力的强弱方面明显优于一般的吸附色谱，是一种具

22、有极高分析应用价值的吸附分离手段。所以许多典型的免疫亲和膜纯化蛋白质的过程都使用了单克隆抗体作为亲和配基22。Denizli23采用光接枝聚合法，将血液相容性较好的甲基丙烯酰氨苯丙氨酸(MAPA)与聚羟乙基甲基丙烯酸酯(pHEMA)制备成共聚膜，经溴化氰活化后，将低密度脂蛋白抗体偶联到膜表面，制备成免疫亲和膜，用于从人血浆中分离低密度脂蛋白。 高志红等24以CA为亲和基质，分别交连PEI及HPC，制备CA /PEI及CA/HPC亲和膜；采用动态吸附法，比较吸附前后肝硬化腹水中内毒素、白蛋白、免疫球蛋白( IgG、IgA、Ig M )、离子( K+、Na+、Cl-)及胆红素浓度的变化。结果表明，

23、这两种亲和膜吸附前后腹水中的内毒素浓度显著降低(P 0.01)；腹水中的白蛋白、免疫球蛋白、电解质浓度过膜前后无明显变化；CA/PEI亲和膜能显著降低腹水中的胆红素的浓度。这说明这两种亲和膜均能有效吸附肝硬化腹水中的内毒素，均可应用于肝硬化自体腹水回输治疗。 姜海容等25以尼龙膜为基膜，采用环氧氯丙烷活化共价偶联壳聚糖，制备尼龙-壳聚糖复合膜，膜上偶联壳聚糖的含量达 98.2 mg/(g膜)，为配基的固载提供了大量活性位点。再次采用环氧氯丙烷活化复合膜，进而偶联亚氨二乙酸(IDA)、固定化Cu2+，获得金属螯合尼龙-壳聚糖复合型亲和膜，配基Cu2+固载量为 5.4molcm2。以牛血清白蛋白为

24、目标蛋白，考察亲和膜的分离性能。研究结果表明，牛血清白蛋白在膜上的吸附行为符合Langmuir 吸附等温方程，膜对牛血清白蛋白具有较好的亲和吸附效果，吸附容量达 1.09 mgcm2。该膜具有较长的使用寿命并且容易再生。Dosio等26利用阳离子IMC从免疫毒素中分离出了未反应的单克隆抗体。与羟磷灰石HPLC相比，虽然分离纯度差不多，但分离步骤却大为简化。尽管染料亲和层析也广泛用于免疫毒素的分离，但是染料配基与核糖体抑活蛋白( RIP) 之间的相互作用不够稳定，而且受离子强度和pH 的影响较大。另外,至少对A-丝林霉素和灭叠球菌素来说，亲和结合并不完全( 65%- 90% )。因此，在内毒素的

25、分离中，采用IMC更为理想。4.3.生物亲和色谱膜生物亲和色谱膜是以一些生物酶为配基，如氨基酸，染料等，近来一些大分子配基如壳聚糖、多肽、蛋白质与一些生物大分子相结合，复合成新型生物亲和色谱膜，也广泛应用于生物产品分离纯化等领域。张海涛等27以纤维素滤纸膜为载体，染料Cibacron Blue F3GA为配基，制备了一种新型亲和膜色谱介质。采用扫描电镜、红外光谱、元素分析等方法对亲和膜介质进行鉴定与表征，该膜具有良好的色谱性能。亲和膜对 F3GA的键合质量摩尔浓度达 93.7mol/g。研究了木瓜蛋白酶在亲和膜上的吸附行为，实验表明：在30下，酶质量浓度为 2 mg/mL、 pH = 8.0时

26、，吸附质量比可达57.9 mg/g，改变pH值及离子强度等条件对吸附质量比有明显的影响。在最适条件下吸附遵循 Langmuir型吸附。可以初步推断，纤维素滤纸膜可以制成性能优良的亲和膜色谱介质，成本低廉，适合工业化分离纯化生物大分子。孙彦伟等28以邻苯二甲酰亚胺钠盐为亲核取代试剂，通过Gabriel反应，成功地将氯甲基化聚砜(CMPSF)转化为酰胺化聚砜(PIPSF)；考察了溶剂的极性、反应温度及反应时间等因素对反应规律的影响，并用FT-IR 表征了PIPSF的结构。利用相转化法制备PIPSF/PSF共混亲和膜，研究不同共混质量比下膜的结构性能，并用扫描电镜分析膜的断面结构；采用该亲和膜对对硝

27、基苯酚进行吸附行为研究。结果表明：亲和膜对对硝基苯酚的吸附随溶液中对硝基苯酚浓度的增加而增加，最大吸附量为11.23mg/g，吸附行为满足Freundlich吸附等温式。 王洪刚等29研究了聚酰胺亲和膜的介质-膜包对透析液中内毒素的去除性能。用鲎试剂法测定透析液中内毒素。结果表明，随着流速的增加，内毒素去除率有所下降；温度对水溶液中内毒素的去除影响不明显；含白蛋白透析液中内毒素的去除率较低。由此看出聚酰胺亲和膜包可有效去除透析液中内毒素，且可较高的保留各种物质的有效成分。徐堃等30以L-丝氨酸(Ser)为配基，1,6-己二胺为间隔臂，制备了一种新型PVDF中空纤维亲和膜用于人血浆中内毒素的脱除

28、。通过FTIR、XPS对PVDF中空纤维膜，亲水化改性膜以及亲和膜的结构进行了表征；探讨了离子强度、pH值对亲和膜吸附内毒素能力的影响以及内毒素分子在亲和膜上的吸附动力学。实验考察了自制的亲和膜组件用于人血浆中内毒素的脱除效果。结果表明，亲和膜对内毒素的吸附能力为0.058EU/cm2；自制的亲和膜组件对内毒素含量为0.42EU/mL的人血浆样品清除率为43.8%。薛茂强等31以尼龙膜为基膜，采用甲醛活化法偶联壳聚糖制备尼龙-壳聚糖复合膜；再用1,4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚对其进行活化并固载聚赖氨酸作为配基，制备亲和膜。膜上壳聚糖和聚赖氨酸的含量分别为112.4和92. 3mg/g尼龙膜。通

29、过静态和动态实验测定了胆红素在膜上的吸附性能，结果表明，胆红素在膜上的吸附平衡符合Freundlich方程；在较高的温度、较低的离子强度下胆红素的去除效果较好；在动态操作条件下容易达到吸附平衡，并对结合胆红素具有较好的清除效果。5.存在问题亲和膜因高选择性和高纯化度，在蛋白质、酶制剂等的提取与纯化方面有较大的应用前景，但受到膜材料和配基等方面的限制。为完善和推广这项技术， 近几年内应在以下几方面待进一步提高。 (1)理想基膜的研制，包括基膜材料与基膜结构。对基膜材料的亲水与疏水性，耐碱、耐酸、耐溶剂性，足够的抗压与耐摩性等；基膜的孔结构、孔径分布、表面可反应基团数等。(2)特异性配基筛选和固定

30、化。根据被结合目标分子的特性，开展特种软件进行分子设计，弄清配基与目标分子之间的相互作用机理。筛选或制备出特异性配基，并通过合适的方法将其固定在膜上。(3)研究复杂体系的亲和纯化模型。模型确定亲和纯化的操作条件,使生产达到最优化，从而最大限度地利用膜上配基、增加产率及活性收率。(4)采用微处理器来控制其操作过程，实现亲和膜分离过程吸附、清洗、洗脱、再生的自动化。6.展望 亲和膜分离技术兼具亲和色谱和膜分离的优点，分离过程选择性好、特异性高，而且操作简便，易于放大，将成为生物分离工程中的一项重要技术。然而，毕竟这门技术还很年轻，因此有待进一步的探索和研究，今后工作的重点应集中在寻找更理想的膜材料

31、、开发新型的活化方法、寻找合适的配基；解决目前广泛存在的膜污染的问题；更深入地揭示亲和作用原理；分离理论的进一步完善以及亲和膜分离技术的放大研究。参考文献1 Klein E.Affinity membrane:Their chemistry and performance in adsorptive separation processesM.Wiley/Inter- science.1991.New York.2 黄竹,袁勤生.以硅胶和Agarose 6B为载体金属螯合亲和层析分离纯化重组人Cu,Zn-SODJ.药物生物技术,2001,8(5):255.3 唐欢欢,代永盛,薛红丹.新型亲和技

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