啤酒风味老化和抗老化

1、啤酒风味老化和抗老化 Studies on Beer Flavor Staling江南大学（原无锡轻工大学）江南大学（原无锡轻工大学）·青岛啤酒股份有限公司联合研究中心Tsingtao Brewery Co., Ltd.Southern Yangtze University (original Wuxi Light Industry University) Joint Institute摘 要 本研究课题是针对目前国内啤酒风味稳定性的现状，在青岛啤酒股份有限公司大力支持下开展研究的。啤酒风味稳定性是当今啤酒高质量的主要标志之一，随着啤酒生产技术的进步，国外高质量的啤酒如美国AB公司的

2、Budweiser、荷兰Heineken、丹麦Carlsberg等瓶装啤酒在常温下储存均有3个月以上的保鲜期，而我国同一质量品质的啤酒风味稳定性只有2030天。稳定啤酒风味，延长其保鲜期是当前啤酒生产厂家面临的最大的挑战。本论文通过对a辅料大米对啤酒风味老化的影响、b制麦过程中影响啤酒风味老化的氧化还原酶系及其它影响因素、c麦汁制备过程中影响风味老化的因素及抗老化、d啤酒风味老化的重要前驱氢过氧化物等的研究，使啤酒风味稳定性由目前的一个月左右提高至两个月。关键词大米、氧化还原酶、羰基化合物、氢过氧化物、不饱和脂肪酸、风味老化AbstractStale rice and fresh rice a

3、re applied to brew to study the effect on beer flavor staling. Lipid decrease and fatty acid increase along with rice staling. Meanwhile, the wort is made by the rice. Free unsaturated fatty acid and carbonyl compound in wort obviously increase. So the quality of rice is the main factor that cause t

4、he processor of flavor staling increasing. Then, the fermentation test is carried out, which adjunct is fresh rice and stale rice respectively. The resistance-staling-value (RSV) of bottle beer of two batch fermentation is determinated. It is proved that the quality of rice is very important at the

5、beer staling flavor.The enzymes suggested by the literature to promote oxidation during mashing can cause the substrate to produce a great amount of precursors of staling substances. In these enzymes, peroxidase is more important than others because of its high heat-resistance and low substrate-spec

6、ificity. There are two paths to reduce the effect of them in brewing. First, the reasonable extension of time from 50to70in kilning can decrease effectively the activity of these enzymes in malt. Second, the avoidance of oxygen uptake during mashing at 50and 60can economically and effectively decrea

7、se the content of the staling precursors from the inhibition of the part of activities of these enzymes. Although these malts have the same quality standard, the content of these enzymes vary greatly with varieties of malt. It is one of the main reasons that the flavor stability in bottles fluctuate

8、 in those plants that often change their raw material.The hydroperoxides that are produced by oxidation of unsaturated fatty acid are the important precursors that can indirectly or directly decompose to the corresponding aldehyde to effect the beer flavor. There are two paths to produce the hydrope

9、roxides, which are the enzymatic oxidation and nonenzymatic oxidation of unsaturated fatty acid. The effect of the latter is more much than that of the former. Meanwhile, the nonenzymaitc oxidation is drastic from 50to 85in mashing and filtering. Thiobarbituric acid (TBA) is used to measure the quan

10、tities of carbonyls and hydroperoxides, and GC analysis is used to trace the unsaturated fatty acid.Key word: rice, carbonyl compound, hydroperoxides, unsaturated fatty acid, oxidase, staling flavor第一章 绪论 啤酒是经酵母发酵麦汁产生的低酒精的含CO2的饮料，作为一种大众化的食品，它的风味、泡沫及色泽是影响消费者消费的三大最重要的因素，其中又以风味的影响尤为突出。 目前为止，已经知道啤酒中含有80

11、0多种有机和无机的化合物，在这个复杂的体系中，一些物质形成了啤酒特有的主体风味，而另一些物质又通过一系列复杂的物理化学过程（陈化过程）在改变着这种风味，缩短啤酒的保鲜时间。因此，稳定啤酒风味，延长其保鲜期是当前啤酒生产厂家面临的最大的挑战，也是众多的风味化学家及酿造师研究的主要领域。一概述 啤酒的风味是动态变化的即从新鲜到陈化的动态变化过程， Drort等人于1971年首先提出了啤酒风味老化的过程4： a.比较弱的不正常的甜味，总体口味仍属正常。 b.较重的有点象葡萄的甜味。 c.极重的带有点蜂蜜味道的甜味。 d.刺激的气味，纸板味，皮革味。 e.极重的甜味，威士忌味，氧化味。 图1保存期内风

12、味变化上述过程可用图1来形象地描述，两条实线表明在老化过程中风味的主要变化，甜味的逐渐增加，苦味的逐渐减少。随着甜味的增加，纸板味、醋栗味相继出现，随着时间的延长，啤酒的杀口性、收敛性逐渐地变弱消失，而纸板味、醋栗味逐渐增强。醋栗味的出现，某种程度上可以作为啤酒开始陈旧老化的“风味指示剂6(由于醋栗味出现时，啤酒的浊度还没有变化，而随着浊度的增加，苦味值降低，甜味增加，风味明显老化)，啤酒中醋栗味的迅速增加与啤酒的氧化降解紧密相关(后将述及)，因此，抗老化实际上是避免啤酒氧化。 大量的实验证明，羰基类化合物是影响风味的最主要的化合物166，在啤酒中已知的羰基化合物有98种(51种醛，47种酮)

13、17.Owades和Jakovae的关于氧原子的经典实验2，在瓶装啤酒的瓶颈空气中引入18O2，经过一段时间的贮存后，发现6518O原子被整合进入多酚分子中，5整合进了异酸的衍生物中，30整合进入挥发性的羰基化合物，证明了羰基化合物是成品啤酒中与风味老化相关的最重要的一类物质。后来，Wheel等人621，在陈化的啤酒中，加入几滴2,4-二硝基苯肼溶液吸收羰基化合物，结果老化味全部消失，由此更加证实了上述推断。羰基化合物，除乙醛、双乙酰等物质外，长链的不饱和的醛是风味老化最重要的物质群，如壬烯醛4、羟甲基糠醛422在老化啤酒中具有纸板味，还有一些类似于壬烯醛的另一些醛（2-庚烯醛12、2-辛烯醛

14、14），对风味老化的影响尚不清楚，但可以肯定它们在啤酒老化过程中也起着重要作用。图2表示风味老化的物质流.OH图2风味老化的物质流光氧化CO2呋喃吡咯噻吩吡嗪还原糖(成品中)还原酮氨基酸(成品中)不饱和醛氢过氧化物或二、三羟基酸不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸酯(长链)饱和脂肪酸(短链)脂肪(来自原料) (不饱和)(饱和)脂肪酸风味老化 发酵过程酚酸(来自酒花、大麦)类胡萝卜素(来自酒花、大麦)酚，酮-紫罗酮多酚(来自酒花、大麦)异草律酮(来自酒花)氢过氧化物(9-LOOH13-LOOH)发酵过程氧化-H2O +NH3 +H2SStrecker降解聚合Strecker降解·OH·O

15、OH醇醛缩合 (核黄素 类黑色素黄素衍生物)光氧化·OH·OOH脱饱和冷凝固物冷凝固物脂肪酶脂肪酸氧化酶美拉德反应-酮 酸还原糖(来自原料)氨基酸(来自大麦)高级醇和杂醇饱和醛脱羧酶CO2NADNADH2NH3EMP途径·OH .CH2OCH2OHCH=O .OOHCH=O说明表示抑制曲线多酚及异草律酮类黑色素由图可见，羰基化合物的生成主要有以下几条途径：a.高级醇通过类黑色素来氧化，及高级醇自动氧化18。b.氨基酸的strecker降解102011。c.酒花物质的降解18113718。d.不饱和脂肪酸的自动氧化及光氧化315918。由文献可知23，图2中每种类型

16、物质的氧化降解都必须经过一系列的氧化还原中间物质（如：类黑色素、多酚、过氧化物等），才能最终形成影响风味老化的羰基化合物，而类黑色素、多酚、过氧化物等中间物质的多少，主要取决于原料及制麦、糖化过程的影响。 在制麦及麦汁制备过程中，美拉德反应的进行产生大量的类黑色素，其本身无有害的风味，但它可以催化或通过其氧化还原能力来使其它物质形成老化风味7。随着制麦温度的升高，当温度达到50，水份大于10%，美拉德反应被激活，还原糖和少量的-氨基化合物经过一系列的反应，重排和脱氢形成还原酮及羟基还原酮(具有双羰基结构的一类物质)，大部分还原酮聚合形成类黑色素，直接影响啤酒色泽及氧化还原特性，Hartong等

17、人证明5，瓶装啤酒中，只要色度不加深，其风味就基本不会改变。由此可见，类黑色素在啤酒风味中的影响地位。类黑色素促使啤酒色度变深和醛浓的增加，另一些还原酮降解后，与胺中N、S、H2S反应形成挥发性的杂环化合物，如：脱水形成呋喃，加氨形成吡咯，加H2S形成噻唑。美拉德反应依靠不同浓度和组成的糖源、含N化合物及热条件，提供了大量的风味化合物。其中呋喃中的5-甲基-2-糠醛和5-羧甲基-2-糠醛，2-乙酰呋喃是啤酒老化风味的重要的代表性物质。在制麦、糖化过程80以上的高温下，美拉德反应一直持续剧烈反应，直至麦汁冷却。在成品啤酒中的美拉德反应，由于其所处温度条件不是很高，其产生类黑色素的量远小于制麦中产

18、生的，因此成品中的类黑色素主要来自于制麦、糖化阶段。而成品中氨基酸与还原糖缓慢反应形成类黑色素是其色度加深的重要原因。 N HR SR OR聚合+氨基酸Strecker降解呋喃吡咯噻吩吡嗪还原糖-氨基氮-氨基酮还原酮类黑色素O2-H2O+NH3+H2S NR N 图3.美拉德反应 原料大麦提供给啤酒大量的多酚(如花色苷(anthocyanogen)，儿茶酸(catechins)等)。在制麦阶段，多酚氧化酶、过氧化氢酶及过氧化物酶能促使多酚的氧化。多酚物质不仅对非生物稳定性有影响，而且对风味也有影响（尽管多酚本身无风味活性）。多酚物质影响风味的途径有以下四条2： a.由于改变聚合度而改变风味物质

19、的主体香。 b.通过改变啤酒体系的氧化还原能力来改变其它物质的香味。 c.通过与其它类的底物发生化学和酶催化反应，产生新的风味物质。d.通过物理的作用，包含其它小分子的物质，产生区别于个别化合物混合后的风味特征的特殊风味特征。由于多酚包含大量具有还原能力的物质，且其易于反应、条件温和，因此多酚物质对啤酒氧化还原能力有极大的影响。一定量的多酚的存在，可以减轻啤酒中分子氧的危害，但由于多酚本身也是啤酒生产中氧化还原反应链的底物及中间物质，因此，过多的含量反而会对风味有负面的影响。OOHCOOHOH OHCOOH脂肪酸不饱和脂肪酸脂肪酶脂肪酸氧化酶2H+异构化麦汁中由脂肪酸酶系催化形成二羟基酸COO

20、H·COOHCOOHOHOOHCOOH饱和脂肪酸脱饱和H2O·OOH·OH成品中由自由基催化形成过氧化物及单羟机酸 OH OHCOOHOHCCOOHCHO壬烯醛COOHOHCOOHCHO丁醛OOHCOOHCOOHCHO1,4-己二烯醛成品中由单、二羟基酸及过氧化物形成羰基化合物过氧化物作为不饱和脂肪酸与风味老化物质-羰基化合物的反应中介，由不饱和脂肪酸在热作用和酶作用下于糖化过程中大量形成(图4)，这些过氧化物与成品中自由基氧化的过氧化物一起分解形成羰基化合物，同时其作为具有氧化还原能力的中间物质影响风味老化。 图4.经氢过氧化物不饱和脂肪酸形成羰基化合物成品啤酒

21、中，由于经巴氏灭菌后酶量极少，因此，大部分氧化还原反应均为非酶体系的反应，在非酶体系下，由上述中间物质及亚铁离子、铜离子形成一条氧化还原偶合链2，如图5。氧化态B还原态A还原态CA氧化态B还原态C氧化态氧化态D还原态H2O还原态EH2O2D还原态E氧化态O2氧化态还原态XX氧化态(氧化阶段)(过氧化阶段)风味改变不显著风味明显改变 图5.氧化还原偶合链图中A为链起始物，如：抗坏血酸、醇类等。B、C、D、E为具有氧化还原能力的底物，如：卟啉及一些有机催化剂17（如：多酚、异咯嗪、类黑色素等）、金属离子（亚铁离子、铜离子等）及它们的复合物均为具有氧化还原态的中间底物。X为最终氧化产物。由图可以看出

22、在X的氧化过程中，氧气并不直接与X作用，而是通过B、C、D、E等中间物质的氧化还原态的转化最后氧化X，当A、D已经被氧化后，从啤酒中去除氧气并不能阻止最后X的氧化，由此可见，氧化还原中间物质与结合氧在啤酒中的存在就象定时炸弹，经过一段时间反应，在链上传递，最终产生氧化物质，危害啤酒风味。这也是一些瓶装啤酒，瓶颈空气并不多，但老化味却非常严重的主要原因之一。 由此可见，多酚类物质、类黑色素、氢过氧化物、脂肪酸是风味老化的最主要的前驱物质。二立题依据 从上述分析可知，在啤酒生产的前期过程中-从制麦到糖化，在麦芽中的过氧化物酶、多酚氧化酶、脂肪酸氧化酶等酶及热的作用下，风味老化物质的前体已经大量的形

23、成。在成品阶段，这些物质进一步反应(氧化还原链反应、自分解反应)产生羰基化合物影响啤酒风味。由此可见，目前，国内大多数啤酒厂所采用的手段，如，减少瓶颈空气，使瓶颈空气小于1ml/瓶，用维生素C钠盐、异维生素C钠盐、二氧化硫等还原剂添加到成品中，没有从问题产生的根源上去解决处理，而只是一些补救措施。因此，本课题通过对上述影响因素的分析，结合目前啤酒界科研与生产中的一些实际情况，如广泛使用大米作为辅料，但对其质量品质对成品风味的影响研究不够；麦芽作为啤酒生产的主要原料，其含有较多的氧化还原酶，而这些酶在制麦及糖化过程中的变化和作用对麦汁中风味老化前驱物质的影响未做深入研究；过氧化物作为不饱和脂肪酸

24、与羰基化合物的中介物质，对风味老化具有不可忽视的影响，而目前对其的研究尚未见报到；等，从以下几点着手开展研究1不同新陈度的大米及陈谷新米、陈米对成品风味老化的影响。2不同品种麦芽及其在焙燥过程中与风味老化前驱物质形成有关的氧化还原酶系的研究。3麦汁制备过程中氧化还原酶系及其它风味老化前驱物质的研究和其对成品风味老化的影响。4风味老化的重要前驱氢过氧化物的研究。第二章 辅料大米对啤酒风味老化的影响 本文通过对大米辅料陈化的研究，发现其对成品风味老化的影响远远超过人们想象。随着大米陈化时间的延长，其粗脂肪含量减少，脂肪酸值增加，用同批次的大米作辅料制得的麦汁，老化风味的主要物质羰基化合物增加，老化

25、风味的主要前驱物质不饱和游离脂肪酸也相应增多，不饱和游离脂肪酸在酿造过程及成品中可以通过酶氧化和非酶氧化为过氧化物，进一步分解形成羰基化合物。因此，我们用一立方米的中试设备，作了陈谷新米与陈米酿造啤酒的对照，成品的风味稳定性有相当大的差别，进一步证明了，大米辅料对老化风味的影响。一试验材料和方法（一）材料1麦芽：澳大利亚大麦，国内制麦生产2大米：陈化用大米东北新粳米中试用大米储藏四个月的苏北陈谷新粳米及同批次储藏四个月的苏北陈粳米3菌种：青岛啤酒酵母（二）试剂1柠檬酸铁铵(分析纯)和光纯药工业株式会社2羧甲基纤维素(分析纯)上海化学试剂采购供应站3茚三酮(分析纯)上海化学试剂厂4邻苯二胺(分析

26、纯)和光纯药工业株式会社5硫代巴比妥酸(分析纯)上海化学试剂厂6愈创木酚(分析纯)上海化学试剂厂7乙二胺四乙酸二钠(分析纯)无锡东湖塘化学试剂厂8愈创木酚(分析纯)上海化学试剂厂9三氟化硼(分析纯)上海化学试剂厂10色谱内标(色谱纯)上海化学试剂厂 十五碳酸、十七碳酸11色谱标准(色谱纯)SIGMA公司 棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸12超纯水无锡华晶电子集团公司（三）主要仪器与设备1索氏(Soxhlet)抽提装置 2TS-2型糖化仪北京轻工发酵研究所3EBC标准磨德国Buhler-Miag公司47520型分光光度计上海分析仪器厂5凯式定氮仪6浊度仪Lg-automatic Aps De

27、nmark7EBC色度仪Lovibond公司83700气相色谱仪北京分析仪器厂9旋转蒸发仪上海医械专机厂101立方米啤酒小试装置德国蒙克尔公司(四)分析与研究方法1分析方法(1)原料粗脂肪测定1(2)大米脂肪酸值的测定2(3)新陈大米的判断（愈创木酚法）25g大米置于试管中，加入1%愈创木酚溶液10ml，振荡2分钟，将液体移入另一试管中，静置，加入1%过氧化氢也3滴，观察显色程度。新大米为浅红棕色，陈大米为深棕色，大米越陈，颜色越深。一般用“+”表示，“+”越多表示大米越陈。(4)硫代巴比妥酸(TBA)法测定羰基化合物3取5ml经10000转/分离心的麦汁、啤酒加入2ml含0.33%硫代巴比妥

28、酸的50%乙酸溶液，充分混合，于60水浴中精确加热60分钟，然后，迅速冷却。同时，取5ml离心后麦汁、啤酒加2ml蒸馏水作空白。于530nm下比色。以吸光度来表示TBA值。TBA法主要是测定以二烯醛类(啤酒中风味老化的代表性化合物类)为代表的羰基化合物。(5)风味保鲜期的预测3取同一批次的五瓶啤酒，其中四瓶放置于60水浴中加速陈化，分别停留12、24、36、48小时，一瓶对照先放于冰箱中保存，每到时间限后取出一瓶陈化啤酒放于冰箱中保存。待四个样品全部陈化好后，同3操作（不需作空白，对照即为空白），于530nm下比色，分别对照空白测定不同陈化时间样品的吸光度，即为TBA值。风味保鲜程度(resi

29、stance staling value)表示：RSV=1/4(12/TBA12+24/TBA24+36/TBA36+48/TBA48)说明：RSV值越大，表示成品的保鲜时间越长。(6)麦汁游离脂肪酸的测定4精确量取200ml麦汁，用20克NaCl 饱和，加1ml浓盐酸酸化，加200mlCHCl3/CH3OH(3:1V/V)振荡15分钟，2000转/分离心，保留有机相，加入1mol/L的KOH150ml振荡10分钟，分离，保留水相，加入14ml浓盐酸酸化，冷却后，用150ml CHCl3/CH3OH(3:1V/V)萃取，振荡10分钟，保留有机相，同时用MgSO4干燥有机相，过滤后，30下，用旋

30、转蒸发器浓缩至干。用少量CHCl3/CH3OH(3:1V/V)将浓缩液转至具塞试管中，用氮气进一步吹干。然后，对浓缩样品进行甲酯化处理，加1ml0.5mol的NaOH-CH3OH液于65水浴中皂化10分钟，冷却后，加1mlBF3-CH3OH(14%W/V)于70水浴中甲酯化2分钟，加1ml庚烷，加饱和盐水，于上清液的甲酯层加1ml1.000mg/ml碳十七酸甲酯作内标，进行气相色谱分析。色谱条件：SP3700色谱仪柱 ：50mm×2000mm不锈钢柱，用10%SP-2330浸渍的 80/100目chromsorb W AW填充。载气：N2，流速：47ml/minH2流速：55ml/m

31、in检测器：FIP，检测温度：220柱温：195汽化温度：280纸速：1cm/min衰减：1/4进样量：1l(7)-氨基氮的测定1(8)还原糖的测定1(9)色度的测定1 EBC法(10)总多酚的测定1(11)双乙酰的测定1(12)浸出物的测定1(13)水份的测定1 烘干法(14)酵母细胞数的测定1 血球计数法(15)外观浓度的测定1 比重瓶法(16)酒精、真浓的测定12研究思路(1)陈化大米对麦汁的影响的研究固定同一种麦芽及酒花，以同品种、不同陈化度的大米作辅料按同一工艺曲线进行糖化，辅料比25%，工艺曲线如图1，研究其对麦汁中的不饱和脂肪酸和羰基化合物的影响。(2)陈谷新米和陈米对成品啤酒风

32、味老化的研究用同品种的陈谷新米及其相应的陈米作辅料分别糖化制备麦汁(工艺曲线见图1)，进行发酵，比较其成品啤酒风味保鲜期的长短。发酵曲线见图2。温度() 图1糖化工艺曲线 注糖化升温速率为1/min发酵温度（） 图2发酵工艺曲线二试验结果1大米陈化过程中相关物质的变化通过将大米置于25恒温下陈化，每隔两周取样，测定其新陈度(表1)，其陈化度越来越显著，相应的对其脂肪酸值、粗脂肪含量、水份进行分析，由于陈化过程中，粗脂肪的不断降解，因此，粗脂肪含量不断下降，然后对其粗脂肪含量，脂肪酸值及水分进行分析。粗脂肪随着大米的陈化含量下降(图3)，脂肪酸值随着陈化时间的延长明显升高(图4)，而水分基本保持

33、不变，维持在13%左右。表1大米新陈度陈化时间(周)246812东北大米+ 图3.粗脂肪随大米陈化的变化 图4.脂肪酸值随大米陈化的变化2糖化麦汁的物质变化 利用上述同批次陈化的大米做辅料，固定同一种麦芽（澳麦）及同一种酒花（压榨酒花），将其低温储藏，使其性质保持一致，进行糖化制备麦汁，辅料比25%。随着大米的不断陈化，测定相应制得麦汁的游离脂肪酸，尽管有个别脂肪酸有所波动，但风味老化的主要前驱物质总不饱和脂肪酸是增加的（表2）TBA值也相应的升高（图5），同时，由图5、表2可见，大米陈化初期，不饱和游离脂肪酸及TBA值增加不显著，随着大米陈化度的加深，不饱和脂肪酸及TBA值急剧升高。由此可见

34、，大米辅料对麦汁中风味老化前驱物质的影响不容忽视，尤其是陈化很长时间的大米辅料。五批麦汁的其它常规数据基本相同，如表3所示。 图5.麦汁TBA值随大米陈化的变化表2麦汁游离不饱和脂肪酸随大米陈化度的变化时间(周)C16:1(mg/L)C18:1(mg/L)C18:2(mg/L)C18:3(mg/L)总量(mg/L)40.130.1050.23560.070.2030.020.29380.0360.130.140.0850.391120.0650.30.40.0250.79注谱图依次见附图1、2、3、4表3五批麦汁的其它常规数据时间(周)浓度(mg/100ml)色度(EBC)-氨基氮(mg/L)

35、多酚(mg/L)还原糖(g/100ml麦汁)212.0188.5177127.19.24412.2088.5170131.29.12611.9188.5164120.69.04812.1088.5168124.39.301212.1788.5180130.09.163一立方米罐发酵的中试结果由上面的结果，可见陈米的影响，因此，我们用同一品种的大米，一个是碾好的米放置4个月，另一个是同批次的稻谷放置4个月后再碾的米，两个样品大米的分析数据见(表4)，由表可见，经过4个月的常温储藏，陈米的粗脂肪含量减少了近一半，而脂肪酸值比陈谷新米高6倍，两者差别相当大。由这两种大米作辅料制备麦汁，陈米麦汁的不饱

36、和脂肪酸总量比陈谷新米高出近3倍(表5)，TBA值也高出了1倍(表6)，麦汁其它常规数据基本无变化(表6)。表4大米分析新陈度水份(%)粗脂肪含量(%)脂肪酸值(mgKOH/100g)陈谷新米+13.10.774.00陈米+13.30.3527.00表5两批麦汁的不饱和游离脂肪酸对照C16:1(mg/L)C18:1(mg/L)C18:2(mg/L)C18:3(mg/L)总量(mg/L)新米麦汁0.160.1410.2070.06150.570陈米麦汁0.0650.350.6850.1651.875注谱图依次见附图5、6表6两批麦汁的其它数据对比多酚mg/L色度(EBC)-N(mg/L)浓度(P

37、)TBA值新米麦汁110.4214.612.00.380陈米麦汁108.5220.011.90.610由这两种麦汁进行1立方米的发酵试验，酵母数变化如图6，浓度变化如图7，双乙酰变化如图8。由图6、图7、图8可知，由于使用同种酵母、相同的接种量， 图6.两批中试酵母数的对比因此，细胞数、双乙酰、浓度的变化基本相同，无太大的差别，而TBA值的变化(图9)，陈米发酵液TBA值的变化与新米发酵液TBA的变化始终相差0.2个单位左右，直至成品啤酒中。 图7主酵期间外观浓度变化的对照 图8发酵过程中双乙酰变化的对照 图9.两批中试的TBA值变化曲线由此可见在工厂大生产中，在同种生产菌种、各批次发酵的酵母

38、数基本相同的前提下，原料的品质是成品风味保鲜期长短的关键因素。经罐装，巴氏杀菌后新米的成品啤酒的RSV保鲜期预测数据比陈米酿制的啤酒高，也比用同种酵母大生产出来的成品啤酒高（图10）。成品的TBA值陈米的也远远高于新米，同时，做成品品尝试验(表7)，可得陈谷新米有近六周的保鲜期，而陈米只有不到四周的保鲜期。成品的其它指标见(表8)。表7成品品尝试验储藏时间(周)陈米的成品陈谷新米的成品1234561234567甲乙丙丁注“”表示无老化味，“”表示有老化味表8成品酒的其它指标TBA值双乙酰(mg/L)多酚mg/L色度(EBC)真浓(%)真正发酵度(%)陈谷新米0.580.1094.66.06.5

39、5.164.2陈米0.790.0995.26.06.55.063.9 图10.中试成品RSV值与对照的对比三讨论 由结果可以看出，大米的影响不容忽视，尽管大米中的脂肪含量只有00000000000000000000000000.3-0.5%，但，随着陈化时间的延长，其游离脂肪酸的量渐渐增多，由其制得的麦汁游离脂肪酸也相应的增高，至此，我们已经能够看出，不同陈化度的大米对酿造的影响，通过对同年产的陈谷新米和陈米进行对照中试生产，陈谷新米的TBA值明显低于陈米的，从RSV值也能看出，陈谷新米的保鲜期值要比陈米高30%，同时，我们作了保鲜试验，陈米做辅料的酒老化味出现不超过四周，而陈谷新米有近六周的

40、保鲜期，由此可见，大米的品质对风味老化的影响远远大于以往人们的认为，特别对于我国，大多数啤酒厂都是用大米作辅料，因此，大米的质量应该得到足够的重视，如在辅料均为精米的前提下，使用碾米1-2周的新米进行酿造，可以从一个方面提高啤酒的保鲜期。第三章 制麦过程中影响啤酒风味老化的氧化还原酶系及其它影响因素的研究 麦芽作为啤酒生产的原料，是一个富含酶和各种风味物质及其前驱的体系，其质量对风味老化具有举足轻重的影响，尤其是它的氧化还原酶体系多酚氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、脂肪酸氧化酶等。在糖化过程中，可以影响麦汁的氧化还原能力，并且产生大量的风味老化的前驱物质，其中多酚氧化酶、过氧化物酶可以氧化多酚

41、，多酚作为一类还原性物质，同时又是氧化还原偶合链的起始底物1，具有相当大的影响风味的潜能，多酚氧化酶、过氧化物酶对它作用，形成醌式结构2(图1)，直接影响其含量的高低。CH3OH+ 1/2O2OHOHCH3+ 1/2O2CH3OO+ H2O多酚氧化酶多酚氧化酶OHOHCH3+ H2O2CH3OO+ 2H2O过氧化物酶 图1酚酶氧化形成醌式结构同时，过氧化物酶作为一个专一性不强的酶，其在过氧化氢存在下，还可以催化芳香物质形成过氧化物2。而脂肪酸氧化酶氧化不饱和脂肪酸形成氢过氧化物，氢过氧化物进一步降解产生老化风味的代表性物质羰基化合物23。而过氧化氢酶可与超氧化歧化酶(SOD)共同作用下，使氧处

42、于其基态形式4(图2)，但从目前研究结果来看，过氧化氢酶受热极易失活，还原作用不明显。由上述可知，从这些酶作用的总体角度来看，弊大于利，因此应尽可能的降低它们的酶活。2H2O22H2O + O2过氧化氢酶O2- + O2- + 2H+H2O2 + O2SODNet: 4O2- + 4H+2H2O + 3O2图2过氧化氢酶与超氧化歧化酶的协同作用 另外，麦芽中的多酚、制麦焙燥过程中美拉德反应的进行产生大量的类黑色素，都是具有氧化还原能力的物质9，在成品中，直接影响啤酒色泽及氧化还原特性。一实验材料与研究方法(一)原料1制麦用大麦苏北大麦2对比试验用麦芽 a.加麦A进口加拿大二棱大麦，国内制麦 b

43、.澳麦进口澳大利亚二棱大麦，国内制麦 c.加麦B进口加拿大麦芽(二)主要试剂1邻苯二酚(化学纯)上海试剂三厂2抗坏血酸(分析纯)上海试剂三厂3过氧化氢(分析纯)宜兴市第二化学试剂厂4硝酸银(分析纯)无锡贵金属电子物料厂5过硫酸铵(分析纯)宜兴市第二化学试剂厂6钼酸钠(分析纯)重庆市北碚化学试剂厂7吐温20(化学纯)浙江温州清明化工厂8亚油酸(化学纯)上海来泽精细化学品研究所9聚乙二醇辛基苯基醚(分析纯)无锡县科技实验二厂10高纯氮气(三)主要仪器与设备1Warburg氏呼吸仪其它仪器与第二章所述的仪器、设备相同。(四)分析与研究方法1分析方法(1)多酚氧化酶的测定a原理5b方法精确称取2克原料

44、，加少量石英砂及pH6.4的磷酸缓冲液于冰浴中研磨，完全移入50ml容量瓶用pH6.4的磷酸缓冲液定容，于4下提取30分钟后，1000转/分离心1分钟，取10ml上清液于三角瓶中，加5ml0.02N抗坏血酸，恒温至20，然后加入5ml事先已恒温至20的0.2%邻苯二酚溶液，同时开始计时，于20水浴中轻轻晃动溶液，准确经过2分钟，加入5ml5%的偏磷酸中止反应，加入1ml0.5%淀粉溶液，用0.010N的碘酸钾溶液滴定至蓝色出现为止。空白用10ml上清液于三角瓶中煮沸，依次加入与上述相同量的偏磷酸、抗坏血酸、邻苯二酚、淀粉溶液，用0.010N的碘酸钾溶液滴定。c酶活计算酶活= 5×(a

45、b)÷n酶活定义：1克绝干麦芽或分析物质，20下1分钟氧化抗坏血酸的微克分子数50.01N抗坏血酸溶液的ml换算为g的系数(a-b)滴定空白和样品用去的碘酸钾的体积差值(ml)n麦芽重量×10÷50。(2)过氧化物酶的测定a原理5b方法精确称取0.5克原料，加少量石英砂及5%的氯化钙溶液于冰浴中研磨，完全移入50ml容量瓶用氯化钙溶液定容，于4下提取30分钟后，3000转/分离心3分钟，取0.1ml上清液于试管中，加蒸馏水至8ml，再加1ml0.3%愈创木酚溶液，浸入20水浴中恒温至20，然后加入1ml事先已恒温至20的0.05N过氧化氢溶液，仍放于20水浴中，准

46、确经过15分钟，迅速于440nm下用10mm比色皿比色。吸取0.1ml滤液稀释至10ml于440nm下比色作空白。c标准曲线的绘制于8只试管中分别加入硝酸银0、0.1、1、2、3、4、5、6ml，每ml含银0.5mg。加蒸馏水至8ml，再加1ml0.3%愈创木酚溶液，浸入20水浴中恒温至20，各试管间隔1分钟加入1ml3%的过硫酸铵溶液，混匀，仍放于20水浴中，各试管准确经过15分钟，迅速于440nm下用10mm比色皿比色。以银浓度对吸光度作标准曲线。 图3过氧化物酶测定的标准曲线d酶活计算酶活 = 50×10×2.53×C÷(15×a

47、5;n)酶活定义：1克绝干麦芽或分析物质，20下1分钟氧化愈创木酚微克分子数C根据标准曲线求得的银浓度(mg/ml)2.5320下1g银存在时，15分钟氧化愈创木酚微克分子数a为了与愈创木酚反应所取的分析液体积(ml)n麦芽重量(g)(3)过氧化氢酶的测定a原理5b方法精确称取2克原料，加少量石英砂及pH7.0的磷酸缓冲液于冰浴中研磨，完全移入100ml容量瓶用pH7.0的磷酸缓冲液定容，3000转/分离心3分钟，取10ml上清液于三角瓶中,用蒸馏水稀释至20ml，恒温至20，然后加入5ml事先已恒温至20的0.1N过氧化氢溶液，同时开始计时，于20水浴中轻轻晃动溶液，准确经过5分钟，加入5m

48、l硫酸(19)中止反应，加入1ml20%碘化钾溶液、3滴10%钼酸铵溶液及1ml0.5%淀粉溶液，用0.020N的硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为止。空白用10ml上清液加10ml蒸馏水于三角瓶中煮沸后，依次加入与上述相同量的硫酸、碘化钾、钼酸铵及淀粉溶液，用硫代硫酸钠溶液滴定。c酶活计算酶活 = 100×293×N(ab)lg(a/b)÷(10×n×5)酶活定义：1克绝干麦芽或分析物质，20下1分钟氧化过氧化氢微克分子数293被消耗的过氧化氢换算成微克分子数的系数a、b滴定空白和样品用去的硫代硫酸钠的体积(ml)n麦芽重量(g)N硫代硫酸钠摩尔

49、浓度(4)脂肪酸氧化酶的测定a原理2b方法精确称取10克原料，加入少量石英砂及20ml蒸馏水于冰浴中研磨至细，将研磨物转移至离心管中，3000转/分离心10分钟，取0.4ml上清液于Warburg氏呼吸仪的反应瓶侧壁内，再取1.0ml底物乳浊液(10ml60%亚油酸中加入2ml聚乙二醇辛基苯基醚及15ml蒸馏水，搅拌使成粘稠状乳浊液)和的磷酸缓冲液于主室中。装好测压计，关闭活塞，恒温至30，将侧壁内容物倾入主室内反应，用秒表计时，准确经过5min后，读取压差(mm)。酶活计算：酶活=(反应瓶常数)×(测压计读数差)/5×10酶活单位：L氧/min·g(绝干物质)(

50、5)氢过氧化物和羰基化合物的测定a原理：氢过氧化物可以被铁离子催化分解产生醛，醛与TBA（thiobarbituric acid）反应的产物于530nm下有最大吸光度，BHT（butylated hydroxytoluene）的加入阻止不饱和脂肪酸在铁离子存在下进一步催化氧化，确保结果的准确。同时，在不外加铁离子的条件下，用TBA测定样品中原有的醛含量，两者的差值即为氢过氧化物含量。由于缺乏可以用来定量该方法的氢过氧化物样品，因此，直接用吸光度数据来表示含量多少。b方法：取25ml麦汁或啤酒样品，用100ml氯仿抽提两次，合并两次的抽提液，3000转/分离心3分钟，取下层氯仿层低于25旋转蒸发至干，再用