凋亡相关基因在眼眶腺样囊性癌组织中的表达意义

1、凋亡相关基因在眼眶腺样囊性癌组织中的表达意义    【摘要】  目的：分析凋亡相关基因p 53和bcl- 2在眼眶腺样囊性癌组织中的表达，分析其关系及临床意义。 方法：免疫组化法检测51例眼眶腺样囊性癌临床标本和10例正常眼眶组织中P53和Bcl-2蛋白的表达状况。 结果：P53和Bcl-2在眼眶腺样囊性癌组织中的表达阳性率分别为53%和 65%，显著高于眼眶正常组织（53%,65%vs 10%，P0.01）。实性型腺样囊性癌中P53的表达率显著高于其在腺样-管状型中的表达率（86% vs 30%，P0.01）；P53和Bcl-2在复发组中的表

2、达率显著高于其在初发组中的表达率（85% vs 42%，P0.01），（100% vs 53%，P0.01）；P53和Bcl-2二者在表达上具有相关性（ 21.461，P0.05）。结论：P53和Bcl-2蛋白的检测对于判断肿瘤对化疗的敏感性和预后有参考价值。 【关键词】  眼眶腺样囊性癌 凋亡相关基因 耐药     0引言    腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma, ACC）是一种高度恶性的上皮性肿瘤，可发生于全身各部位，如涎腺、颌下腺、气管、肺、乳腺、皮肤等，于眼眶则好发于泪腺1。我们

3、通过检测眼眶腺样囊性癌中凋亡相关基因的表达情况，了解并分析凋亡相关基因p 53和bcl- 2在眼眶腺样囊性癌组织中的表达与组织学分型和预后的关系及临床意义。我们采用的基因检测方法是蛋白质水平的免疫组织化学法，它是把血清学方法和显微示踪技术结合起来的一类技术，简便易行,容易掌握，具有较高的抗原抗体反应的特异性和灵敏性，可以对组织细胞的成分准确定位和定量分析。    1材料和方法    1.1材料  免疫组化染色试剂盒（HistostainTM-Plus Kits）（SP-9000），鼠抗人P53 mAb（DO-7）(ZM-04

4、08)，鼠抗人Bcl-2 mAb（Bcl-2-100）(ZM-0010),浓缩型DAB试剂盒（ZLI-9032）,磷酸盐缓冲液（PBS）（配成0.01mol/L，1 000 mL，pH7.27.4）(ZLI-9061)。天津医科大学第二医院眼科病理室1992/2003年手术或活检后经病理组织学确诊的眼眶腺样囊性癌标本共51例，男22例，女29例，右眶20例，左眶31例。年龄1962岁，初发38例，术后复发13例。按组织学分型：腺样-管状型30例，实性型21例。全部标本经40g/L甲醛固定，石蜡包埋，5连续切片，作病理组织学及免疫组化使用。对照组10例，取自相同时期眼眶内良性肿瘤手术中同时取出的

5、眶内正常组织（脂肪、结缔组织、泪腺等），标本处理方法同实验组。    1.2方法  采用过氧化物酶标记的链霉卵白素（streptavidin peroxidase, SP）染色试剂盒。以已知阳性的切片做阳性对照，以PBS代替一抗作空白对照。Bcl-2的阳性产物应定位于细胞膜和/或细胞质，P53的阳性产物应定位于细胞核，呈棕黄色细小颗粒状。以高倍镜下（×400）阳性细胞占肿瘤细胞的百分比为阳性判断标准：0级：无着色；1级：阳性细胞占肿瘤细胞数10；2级：阳性细胞占肿瘤细胞数1050；3级：阳性细胞占肿瘤细胞数50。以01级为阴性（-），23级为阳

6、性（+）（本判断标准由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）。     统计学处理：SPSS统计软件包（Ver10.0），方法采用 2检验，显著性水准为0.05。    2结果    2.1凋亡相关基因在眼眶腺样囊性癌中的表达  研究结果显示，P53和Bcl-2在眼眶腺样囊性癌中均有不同程度的表达。P53的阳性染色为棕黄色，位于细胞质和胞核，胞核呈均匀明显着色，且染色强度高于细胞质。Bcl-2的阳性染色均匀分布于细胞膜和胞质。眼眶腺样囊性癌标本中27例P53表达阳性，阳性率53%，正常组织

7、标本中1例表达阳性，阳性率10%，P53在眼眶腺样囊性癌组织中的表达率显著高于眼眶正常组织(27.128，P0.01）。腺样囊性癌标本中33例Bcl-2表达阳性，阳性率64.7%，正常组织标本中1例表达阳性，阳性率10%，Bcl-2在腺样囊性癌组织中的表达率显著高于眼眶正常组织(211.034，P0.01）。    2.2 P53和Bcl-2的表达与癌组织学分型的关系  P53在实性型腺样囊性癌中18例表达阳性，阳性率86%，在腺样管状型中9例表达阳性，阳性率30%，P53在实性型中的阳性表达率较腺样管状型明显增高，二率比较有显著性差异(216.648，

8、P0.01）。Bcl-2在实性型中15例表达阳性，阳性率71%，在腺样管状型中18例表达阳性，阳性率60.0%，二率比较无显著性差异( 20.715，P0.01)。    2.3 P53和Bcl-2的表达与癌初发与复发的关系  P53在复发组病例中11例表达阳性，阳性率85%，在初发组病例中16例表达阳性，阳性率42%，在复发组中阳性率明显增高，二率比较有显著性差异(2=7.634，P <0.01)。Bcl-2在复发组病例中13例表达阳性，阳性率100%，在初发组病例中20例表达阳性，阳性率53%，在复发组中阳性率明显增高，二率比较有显著性差异(2

9、=13.649，P <0.01)。    2.4 P53和Bcl-2的表达之间的相互关系  对P53和Bcl-2在眼眶ACC中的表达情况进行比较，结果表明，24例二者共同表达阳性，占全部病例的47%，15例二者共同表达阴性，占全部病例的29%，P53与Bcl-2的表达之间具有相关性(2=1.461，P >0.05)。    3讨论     原发于眼眶的泪腺腺样囊性癌是泪腺恶性上皮性肿瘤中最常见的，也是恶性度最高的肿瘤1,2，其发生率在泪腺肿瘤中仅次于泪腺多形性腺瘤居第2位。

10、根据我科对历年诊治眼眶肿瘤的统计情况，腺样囊性癌占上皮性肿瘤的19.2%，占泪腺恶性上皮性肿瘤的41.7%3,4。其发病年龄小于其他泪腺恶性肿瘤，30岁以下患者占一定比例，这在其他泪腺恶性肿瘤中是非常少见的。腺样囊性癌病程较短，多在6mo以内，主要临床表现为眼球突出、移位和眶部肿块。与其他泪腺肿瘤不同的是其疼痛的发生率可高达79%，自发痛和触痛均存在，这是因为该肿瘤具有嗜神经性，肿瘤细胞易侵犯神经，且沿神经束蔓延，引起局部疼痛。影像学检查除发现泪腺区不规则肿物外，常见临近骨质有虫蚀样破坏。肿瘤易向颅内和鼻窦等部位扩散，或侵入周围血管内，形成瘤栓并经血行远处转移。腺样囊性癌虽然生长较为缓慢，但侵

11、袭性强，浸润的范围往往超出手术时肉眼看到的肿瘤范围，因此复发率和病死率均较高，我科统计复发率为77.4%，陈耀真等报道病死率为44.4%。腺样囊性癌的大体标本为灰白色实体肿块，表面有结节，无包膜或包膜不完整，常侵犯周围组织，切面呈灰白或微黄色，可伴有出血或坏死，呈小囊样改变，质脆。镜下腺样囊性癌主要由导管上皮细胞和肌上皮细胞构成，群集成巢或条索状，核深染而胞浆较少的小圆细胞构成。根据目前采用的Perzin分类法5，可分为3型：腺样型，又称筛状型,癌巢中有许多大小不等呈筛孔状的囊样腔隙，囊样间隙多由肌上皮细胞围绕，其内充满嗜碱性粘蛋白；管状型：癌细胞排列成细长管状结构，由二、三层上皮细胞围绕而成

12、，内层为导管上皮，外层为肌上皮细胞，腔内可有嗜伊红分泌物；实性型：肿瘤细胞排列紧密呈团块样，形成圆形或不规则形实性癌巢，中间有纤维间隔，其内可有少量腔隙，较大的团块内可出现坏死。由于腺样型和管状型结构常在同一肿瘤中同时出现，故又将其合并成腺样-管状型。一般认为腺样-管状型预后较好，实体型预后较差。百事通      目前对腺样囊性癌的治疗方法仍以手术为主。目前常用的手术方法是扩大的局部切除术，即手术切除可见的肿瘤组织连同周围的一部分正常组织，尽可能清除肿瘤细胞，术后再辅以放疗或化疗。随着综合治疗理念的逐渐深入，从术后的辅助化疗消灭手术后的残余肿瘤细胞和微小

13、转移灶，到术前新辅助化疗的术前“减瘤作用”，化疗在腺样囊性癌的治疗中占踞了愈来愈重要的地位6。国内外目前有报道用于腺样囊性癌化疗的方案很多,关于疗效的说法也多有不一致之处，其中肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致化疗失败的重要原因。多数化疗药物是通过诱导肿瘤细胞发生程序性死亡，即凋亡来达到治疗目的的，反之，肿瘤细胞也可通过逃逸凋亡或拮抗凋亡获得生存，即产生多药耐药7。细胞凋亡抑制可能是肿瘤细胞耐药的一种标记，而且与细胞凋亡有关的因子在多药耐药形成中起一定作用。近年研究已发现了一些与细胞凋亡抑制有关的癌基因(如bcl-2，突变的p53，Fas/Ap101，Cmyc，raf-1，bcl/abl，cer

14、bB-2/neu，NF-KB)的表达产物可阻断或阻碍多种因素诱导的细胞凋亡，使细胞产生耐药性。bcl-2是最重要的抑制细胞凋亡的基因，定位于18q21，但在多数肿瘤患者中，可发生染色体t（14；18）易位，使bcl-2基因位于14q32，接近Ig重链的转录增强子，导致bcl-2的高度表达。bcl-2基因的编码产物为26ku的蛋白质（P26-Bcl-2）,常位于核膜、线粒体膜和滑面内质网膜上，bcl-2基因的高水平表达与多种化疗药物诱导的细胞凋亡受抑制显著相关。bcl-2过度表达时，可能通过调节抗氧化途径，作用于细胞凋亡过程，使细胞死亡率下降，对抗化疗药物的作用8。p53基因定位于17p13.1

15、，在人类肿瘤发生中起着至关重要的作用，而且最易发生改变。野生型P53对维持细胞正常生长，抑制恶性增殖过程中有着重要作用，其所表达的蛋白产物半衰期较短，无法用免疫组化染色法检测到。突变型p53基因的蛋白产物半衰期明显延长，容易被检测到。所以如果用免疫组化法在癌组织中检测到P53蛋白的表达，则可以认为有p53基因的突变9。p53基因状态与肿瘤细胞对于放疗和化疗的敏感性有关，目前研究认为，野生型p53有DNA复制启动功能，当细胞在放、化疗作用下，DNA不能修复为正常状态时，p53将诱发细胞凋亡，这种机制可抑制细胞增殖，并增强其对放、化疗的敏感性，突变型p53基因则失去了这种细胞调节功能。p53基因的

16、异常和P53蛋白的过度表达在很多恶性肿瘤的发生发展中有着重要的作用，Kopnin等10的研究表明，p53基因对mdrl基因的启动因子有调节作用，野生型p53能够抑制mdrl转录，减少耐药糖蛋白P170的生成，而突变型p53可增强mdrl基因的表达和P170的生成，P170具有药泵作用，能够逆浓度差将进入细胞内的化疗药物排出细胞外，从而保护肿瘤细胞免受攻击，导致肿瘤产生多耐药性，造成化疗失败，这是许多肿瘤对化疗不敏感的重要原因之一。目前国内外均有关于涎腺腺样囊性癌中突变型P53和Bcl-2蛋白表达情况的研究报道，Papadaki等11在对涎腺腺样囊性癌P53的表达的研究中发现，复发性ACC中突变

17、型P53的表达高于初发人群，且与预后密切相关。其它对涎腺ACC中P53和Bcl-2表达情况的研究也表明12，二者在肿瘤中均存在过表达，且复发病例的表达率增高。目前尚未见对眼眶腺样囊性癌中的P53和Bcl-2表达情况进行研究的报道。     本实验结果表明，突变型P53和Bcl-2蛋白在眼眶腺样囊性癌中的表达率均显著高于眼眶正常组织，表明眼眶ACC组织中存在着较为广泛的p53突变和较高的bcl -2表达，二者的共同作用使肿瘤细胞的凋亡过程受到抑制，肿瘤对化疗药物的抗药性增加。P53在实性型ACC中的表达率为86%，明显高于在腺样-管状型ACC中的表达率30

18、%，表明实性型ACC细胞有较强的拮抗凋亡作用，对化疗药物抗药性更高，因而预后较差。复发组突变型P53和Bcl-2蛋白的表达率均显著高于初发组，提示复发性ACC的细胞凋亡过程受到抑制，对化疗药物反应性差，化疗效果不佳。p 53和bcl- 2同属凋亡相关基因，二者相互联系，相互制约。眼眶ACC中P53和Bcl-2的表达具有正相关性，与它们共同在细胞凋亡调控中发挥作用有关，其机制可能为13：野生型P53通过bcl-2家族调控凋亡，p 53激活bax靶基因，使其mRNA和蛋白的表达均升高，形成Bax-Bax同源二聚体，使Bcl-2蛋白失活，诱导细胞凋亡。p 53基因发生突变后，失去了对Bcl-2蛋白的

19、抑制作用，使细胞凋亡受抑制，化疗药物的毒性作用降低。所以，p 53的基因状态与肿瘤细胞对于化疗的敏感性密切相关。同时，bcl -2的高表达还可通过其抗凋亡机制，抑制野生型P53诱导的凋亡，bcl -2的过表达也是导致ACC耐药的重要原因之一10。【参考文献】  1肖利华.眼眶泪腺上皮性肿瘤的影像学诊断.国际眼科杂志,2001;1(4):22-242刘琳,何彦津.泪腺腺样囊性癌的放射治疗.国际眼科杂志,2004;4(5):900-9043宋国祥,吴中耀.眼眶病学.第1版.北京:人民卫生出版社,1999:235-2394宋国祥,侯芝艳,徐大惠.泪腺上皮性肿瘤.眼科新进展,1988;8:1

20、5-185刘复生,刘彤华.肿瘤病理学.第1版.北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1997:6116邱蔚六,林国础,何荣根.辅助性化疗在头颈部恶性肿瘤综合治疗中的应用.中华耳鼻咽喉科杂志,1991;26:337-3397 Desoize B.Anticancer drug resistance and inhibition of apoptosis.Anticancer Res,1994;14:2291-22948 Reed JC.Regulation of apoptosis by bcl-2 family proteins and its role in cancer and chemoresistance.Curr Opin Onco,1995;7:541-5469