ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备

1、ERCC1的表达纯化及其单克隆抗体的制备 作者：李晓杰, 蒋华, 高慧萍, 姚晓, 石必枝 李宗海【摘要】 目的: 表达纯化ERCC1蛋白并制备其单克隆抗体（mAb）。方法: 克隆并原核表达ERCC1蛋白, 其氨基端带有6His标签。纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠, 经融合、 筛选制备特异性mAb。结果: 成功表达了ERCC1蛋白。SDSPAGE显示所表达蛋白的相对分子质量（Mr）约为37 000。获得了1 株稳定分泌抗ERCC1抗体的杂交瘤细胞株（6F8）, 其分泌的mAb的Ig亚类（型）为IgG2b。ELISA检测, 对应腹水mAb的效价为11.5×106。Western bl

2、ot结果显示抗ERCC1 mAb具有良好的特异性。结论: 成功地表达纯化ERCC1蛋白并制备了1株抗ERCC1 mAb。 【关键词】 ERCC1; 原核表达; 纯化; 单克隆抗体 核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）是哺乳动物细胞DNA 修复的主要途径; 切除修复交叉互补基因（excision repair crosscomplementing 1, ERCC1）在核苷酸切除修复过程中起着关键作用。最近, 很多研究表明它的表达与肺癌、 卵巢癌、 头颈部肿瘤对铂类药物的敏感性有密切关系1-3, 其表达有望作为铂类用药的分子标记。但是迄今为止, 国内尚无

3、制备其单克隆抗体(mAb)的报道。我们在本研究中表达纯化了ERCC1蛋白并制备了其mAb, 为将来检测ERCC1奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 pET28a(+)载体、 大肠杆菌BL21（DE3）、 骨髓细胞系Sp2/0、 A431细胞系由本实验室保存。骨髓细胞系Sp2/0以DMEM、 100 mL/L小牛血清, 在37、 50 mL/L CO2条件下培养。A431以DMEM、 100 mL/L胎牛血清, 在37、 50 mL/L CO2条件下培养。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购自Sigma Aldrich。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。GAPDH抗体购自康成生物技术有限公司。H

4、RP标记的羊抗鼠二抗由本实验室制备。其他试剂均为国产分析纯。BALB/c小鼠由本研究所实验病理室提供。 1.2 方法 1.2.1 载体构建及鉴定 以人胎盘 cDNA为模板, 加入针对ERCC1基因的特异引物进行PCR扩增。上游引物ECF为: 5GGAATTCCATATGGACCCTGGGAAGGACAAAGAG3（划线处为Nde 酶切位点）; 下游引物ECR为: 5CCCAAGCTTTCAGGGTACTTTCAAGAAGGGCTCG3 （划线处为Hind 酶切位点）。以KOD plus DNA 聚合酶（ToYoBo）PCR扩增, 反应的条件为: 94 3 min, 然后进行30个循环: 94

5、30 s, 58 30 s, 68 50 s, 最后68延伸10 min。PCR产物纯化回收, 用Nde和Hind 双酶切, 同时用Nde和Hind 进行双酶切pET28a(+) 载体质粒, 在T4 DNA连接酶作用下, 构建重组表达载体pET28a(+)ERCC1。 1.2.2 重组ERCC1蛋白的表达及纯化及复性 用pET28a(+)ERCC1转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑取单克隆接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中, 37震荡培养过夜, 按1100转接, 37培养至A600约为0.6时, 加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L, 20过夜诱导表达。收集菌液, 以10 00

6、0 r/min离心10 min, 弃上清, 用含1 mmol/L PMSF和 1 g/L TritonX100的缓冲液A（20 mmol/L TRIS、 pH7.8、 0.5 mol/L NaCl ）重悬细菌沉淀, 经超声破碎细菌后, 以12 000 r/min 离心10 min。分别取上清和沉淀SDSPAGE电泳确定目的蛋白存在于包涵体中, 包涵体经充分洗涤后以缓冲液A（20 mmol/L TRIS、 pH7.8、 0.5 mol/L NaCl、 0.5 mol/L imidazole、 8 mol/L urea） 溶解。溶解上清采用BioRad DuoFlow层析系统, 进行NiNTA H

7、isBind亲和柱层析, 缓冲液B（20 mmol TRIS、 pH7.8、 0.5 mol/L NaCl、 0.5 mol/L imidazole）梯度洗脱。收集洗脱峰, 100 g/L SDSPAGE鉴定纯化效果。将纯化后的蛋白加到透析袋中, 以含尿素浓度逐步下降的复性缓冲液（20 mmol/L PB, 0.1 mol/L NaCl, 100 g/L甘油, 0.01 mol/L精氨酸, 1 mmol/L还原性谷胱甘肽 , 0.5 mmol/L氧化性谷胱甘肽pH7.8）, 4透析。复性缓冲液尿素浓度分别为4、 3、 2、 1、 0.5、 0.25 mol/L尿素缓冲液。每个浓度透析4 h以上

8、。最后在大体积的PBS中4透析过夜, 离心, 取上清。 1.2.3 小鼠免疫及杂交瘤细胞系的建立 重组ERCC1抗原用PBS稀释并与等量完全弗氏佐剂混合, 充分乳化后, 经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠（50 g/只）。4周后, 抗原与等量不完全弗氏佐剂充分乳化, 经腹腔注射加强免疫, 注射剂量同前。重复加强免疫3次, 每次间隔2周。第3次加强1周后, 小鼠尾静脉取血, 检测抗血清的效价, 取效价高的小鼠, 脾内注射10 g抗原加强免疫, 4 d后, 取脾细胞与骨髓瘤细胞系Sp2/0在PEG4000作用下融合。1周后, 间接ELISA法筛选mAb分泌阳性的杂交瘤细胞。经34次有限稀释法克隆化

9、后, 选择2株mAb分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养。 1.2.4 抗体制备及纯化 BALB/c小鼠预先腹腔注射0.5 mL液体石蜡, 1周后, 每只小鼠腹腔注射2×105相应杂交瘤细胞, 约1周后, 收集小鼠腹水。以硫酸铵差级沉淀法纯化抗体。 1.2.5 ELISA测定效价 采用间接ELISA法。用ERCC1蛋白（1 mg/L）包被聚苯乙烯板。一抗为适当稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水样本, 二抗为12 000的HRP羊抗鼠IgG, 经ABTS底物显色后, 于波长405测定A值。 1.2.6 Western blot分析 生长状态良好的A431细胞用冰预冷的PBS洗两次, 然后加入适

10、量的TPER组织蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂）, 置于冰上30 min, 用细胞刮子将细胞刮下来, 收集细胞裂解液。4、 10 000 g离心10 min, 取上清液, 冻存于-70。BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白定量。配制浓度为120 g/L的SDSPAGE电泳胶, 分别取50 g细胞蛋白上样进行蛋白电泳。电泳完成后使用半干转膜仪进行转膜, 放置好滤纸、 胶、 NC膜, 200 mA, 电转50 min。后将膜取下, 剪角后在50 g/L脱脂奶粉封闭液中缓慢摇动14 h。然后, 将鼠抗人ERCC1特异性抗体(2 g/L)按11 000稀释, 同时加入GAPDH抗体作为内参。与膜一起4孵育过夜,

11、1×PBST 洗涤3次, 每次10 min。随后将此膜与羊抗鼠的HRP标记二抗（12 500）室温孵育1 h。然后1×PBST洗涤3次, 每次10 min。把膜放于Westpico (Pierce) 2 min, 压片, 显影, 检测特异性蛋白条带。 1.2.7 免疫荧光检测 取对数生长期细胞接种到24孔板内盖玻片上, 过夜培养。次日, 用PBS洗2次。细胞用40 g/L多聚甲醛和1 g/L Triton X100固定通透1530 min。用PBS洗3×10 min。用100 mL/L羊血清（或10 g/L BSA）封闭 1 h。将鼠抗人ERCC1特异性抗(2 g

12、/L)按1100稀释, 室温孵育23 h。用PBS洗3次×10 min。随后与的羊抗鼠 FITC绿色荧光标记的二抗（150）室温孵育30 min。用PBS洗 3次, 每次10 min。用封片剂封片。荧光显微镜观察, 拍照。 2 结果 2.1 重组表达质粒的鉴定 质粒pET28aERCC1经Nde 和Hind 进行双酶切分别出现898及5 403 bp的电泳条带（图1）, 与预期大小相符, 说明载体构建正确。 2.2 ERCC1重组蛋白表达纯化和复性 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3), 挑取单克隆诱导培养后, 样品蛋白经SDPAGE电泳, 结果显示有明显的诱导表达的目的蛋白条带（

13、图2）, Mr在37 000左右, 与理论值相符（由于带有pET28a载体上Histag标签等序列, 重组的ERCC1的Mr为37 000）。 细菌经超声破碎后, 发现目的蛋白存在于细菌包涵体中, 以含有8 mol/L尿素的缓冲液溶解包涵体, 并进行NiNTA亲和柱层析一步法得到纯化的目的条带。 纯化的变性ERCC1蛋白在复性缓冲液中进行长时间的逐步透析复性, 最后得到可溶于PBS的 ERCC1目的蛋白（图3）。 2.3 抗ERCC1蛋白mAb的制备和初步鉴定 血清抗体效价最高的免疫小鼠的脾细胞进行融合, 结果筛选到1株阳性克隆, 命名为6F8。经ELISA检测, 6F8腹水效价为11.5&#

14、215;106。Western blot结果显示, 在A431细胞中, Mr为32 500处有一条带, 与ERCC1蛋白的理论值相符。该抗体与重组蛋白ERCC1也有特异结合。进一步用免疫荧光检测, 发现该抗体可以与细胞内的ERCC1结合（图4）。 3 讨论 ERCC1 参与DNA链的剪切及损伤修复, 其过表达可使处于G2/M期的受损DNA 快速修复, 导致其对铂类耐药。用反义技术抑制ERCC1 表达可以抑制DDPDNA 加合物的修复4。在人卵巢癌和胃癌的肿瘤组织及细胞系中ERCC1 表达增高与DDP 抗药有关。 通过定量PCR 分析了肺癌石蜡包埋组织切片中ERCC1mRNA 的表达或免疫组化方

15、法检测ERCC1的表达, 回顾性分析发现ERCC1 高表达者对铂类抵抗, 生存率明显低于低表达或不表达者1。根据这些研究, 如果ERCC1表达阳性选择其他化疗药如健择, 如果表达阴性则选择铂类。所以ERCC1的表达检测有望为肿瘤如非小细胞肺癌的个体化治疗提供依据。 我们构建了原核表达载体pET28aERCC1, 鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达羧基端含6×His标签的ERCC1蛋白。利用6×His标签和镍离子特异性螯合的特性纯化及复性后, 得到高纯度的目的蛋白。以纯化ERCC1 蛋白为抗原, 通过杂交瘤技术成功获得了抗ERCC1的mAb, 该抗体可用于West

16、ern blot或免疫荧光检测细胞内的ERCC1蛋白, 为将来制备ERCC1表达检测试剂盒奠定基础。【参考文献】 1 Cobo M, Isla D, Massuti B, et al. Customizing cisplatin based on quantitative excision repair crosscomplementing 1 mRNA expression: A phase III trial in nonsmallcell lung cancerJ. J Clin Oncol, 2007, 25(19): 2747-2754.2 Smith S, Su D, Rigaul

17、t de la Longrais IA, et al. ERCC1 genotype and phenotype in epithelial ovarian cancer identify patients likely to benefit from paclitaxel treatment in addition to platinumbased therapyJ. J Clin Oncol, 2007, 25(33): 5172-5179. 3 HandraLuca A, Hernandez J, Mountzios G, et al. Excision repair cross complementation group 1 immunohistochemical expression predicts objective response and cancerspecific survival in patients treated by Cisplatinbased induction chemotherapy for locally advanced head and neck squamous cell carcinomaJ. Clin Cancer Res, 20