Leptin对Leptin受体在GH3细胞中表达的影响

1、Leptin对Leptin受体在GH3细胞中表达的影响 作者：刘亚莉，钟延清，朱运龙，迟素敏 【关键词】 瘦素；GH3细胞；leptin受体 【Abstract】 AIM: To observe the influence of leptin on the expression level of leptin receptors (OBR) in the cultured GH3 cells. METHODS: RTPCR method was used to observe the expression of leptin receptors (OBR) and its change in

2、GH3 cells. RESULTS: There were three subtypes of leptin receptors mRNA expressed in GH3 cells, including OBR (common form), OBRa (short form) and OBRb (long form). After leptin (10-8 mol/L) treatment for 48h, OBRa and OBRb mRNA levels in GH3 cells were increased to (154±11） and (188±9）. CO

3、NCLUSION: Leptin might regulate function of GH3 cells through leptin receptors in GH3 cells directly, including growth, proliferation and GH secretion of GH3 cells. 【Keywords】 Leptin；GH3 cell；leptin receptor 0引言 瘦素(Leptin)是由脂肪组织分泌的一种循环激素，具有多种生理功能，可调控能量代谢、摄食、机体脂肪的沉积以及神经内分泌和生殖功能. Leptin受体（leptin recep

4、tor, 也称OB gene receptor, OBR）属于细胞因子型受体，已发现至少有5种OBR的异型体，分别以a, b, c, d, e来命名. 根据细胞内位点的不同又把OBR分为长受体（OBRb）和短受体. 其中OBRb是长受体，也是主要的效应受体，含有一个由340个氨基酸组成的细胞内位点，这个细胞内位点被认为是Leptin信息传递的第一步；短受体包括OBRa，OBRc，OBRd和OBRe，具有信息转运功能. 有研究显示，Leptin受体在下丘脑、肺、肾、脉络丛及生殖器官等多种组织中均有表达. Yonekura等1发现在牛和大鼠的垂体前叶有Leptin及Leptin 短型受体的表达.

5、在羊的下丘脑有Leptin受体的基因表达2，Leptin受体在人的正常垂体和垂体瘤中均有表达，但在不同种属的不同部位OBR的表达形式不一3-4. 本研究旨在用RTPCR方法观察Leptin受体3种亚型（OBR，OBRa以及OBRb）在大鼠GH3细胞中的表达，探讨Leptin对大鼠GH3细胞中leptin受体表达的影响. 1材料和方法 1.1材料 GH3细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心); Leptin, 胰蛋白酶和EDTA(美国Sigma公司)；DMEM(美国Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；反转录试剂盒,PCR反应试剂盒(美国Promega公司)；Taq

6、 DNA聚合酶和DNA Marker(大连宝生物工程有限公司)；琼脂糖(洛阳华美生物工程公司). 所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成. 1.2方法 1.2.1细胞培养大鼠生长激素瘤GH3细胞在含120 mL/L小牛血清DMEM培养液中常规培养、传代，加入2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA (11)消化细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入含120 mL/L小牛血清的DMEM培养液，轻吹起细胞，调整细胞密度，以5×108/L的密度接种于96孔板，每孔100 mL，移入CO2孵箱，在37，50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养，24 h换液，之后每隔

7、48 h换液1次. 1.2.2逆转录聚合酶链式反应（RTPCR） 1.2.2.1细胞总RNA的提取GH3细胞以5×108/L的密度接种于直径6 cm的培养皿中，移入CO2孵箱中培养，培养条件同上. 培养5 d后，收集细胞，用预冷灭菌的生理盐水洗涤沉淀，将1 mL Trizol加到培养皿中，轻摇培养皿至液体浸润到各处，待细胞悬浮后，将液体移入1.5 mL离心管中，冰上静置5 min，加入200 mL氯仿，震荡混匀，于室温下静置15 min，4，12 000 g离心15 min，小心吸取上层水样（约300400 mL），转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，冰上沉淀10 min，4

8、，12 000 g离心10 min，RNA沉附于管底或管壁. 750 mL/L乙醇洗涤1次，4，7500 g离心10 min，去除乙醇液体，将RNA 沉淀风干，用20 mL无RNA酶水55溶解15 min，-20保存备用. 所有获取的RNA 用分光光度计读取A值，计算RNA的含量，并用A260 nm/A280 nm比值判断RNA的纯度. 1.2.2.2cDNA的合成以提取的总RNA为模板，cDNA合成反应体系为20 L，包括提取的总RNA 5 L，25 mol/L MgCl2 4 L，10×PCR缓冲液2 L，dNTP (10 mmol/L) 2 mL， RNA酶抑制剂0.5 L，A

9、MV反转录酶1 L，Oligo dT 1 L，其余用无RNA酶水补充至20 L，混匀后42水浴60 min，沸水浴5 min灭活反转录酶. 1.2.2.3PCR反应取合成的cDNA模板1 L，依次加入10×PCR缓冲液2.5 L，4×dNTP混合物1 L，Taq DNA聚合酶0.125 L，人OBR, OBRa和OBRb引物各0.5 L（OBR引物：sense：5CTCCGCACTCACAGGCAACA3, antisense：5TGGATCGGG CTTACAACAA3；OBRa引物：sense：5CCTATCGAGAAATATCAGTTTA3, antisense：5T

10、CAAAGA GTGTCCGCTCTCT3；OBRb引物：sense：5AGAATTGTTCCTGGGCACAAG3, antisense：5ACACTCAT CCTCACAGGTTCC3），加无菌去离子水补至25 L，首次循环94 4 min，然后94变性1 min，OBR 63退火1 min，OBRa 55退火1 min，OBRb 65退火1 min，72延伸1 min，末次循环72延伸6 min. 以不加入模板为阴性对照组，18 S为内对照（18 S引物：sense：5CGGCTACCACATCCAAGGAA3，antisense：5GCTGGAATT ACCGCGGCT3）. 取PCR

11、产物10 L，在20 g/L琼脂糖凝胶电泳以×174 DNA/Hae Marker为标准分子量，经凝胶图像分析仪分析结果. 1.2.2.4半定量RTPCR将提取的细胞总RNA 取12 mL，初步进行紫外分析定量. 取5 mg RNA反转录成cDNA，以18 S为内对照进行PCR. 取各组细胞RTPCR产物10 mL，以×174 DNA/Hae Marker为标准分子量,在20 g/L琼脂糖中进行凝胶电泳，电泳结果用UVP成像系统采集染色条带后转入计算机，并用图像分析软件分析各条带密度. 将各产物的密度值与内对照18 S密度值进行比较得到其表达的相对值. 以对照组产物表达的相

12、对值为100%，其余各组表达的相对值与对照组相比较以计算其表达的变化率. 变化率(%)=(试验组值/对照组值)×100%. 统计学处理: 所有数据均以x±Sx表示，组间均数比较用t检验处理，多组间均数比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1OBR在大鼠GH3细胞的表达OBR，OBRa及OBRb的引物进行RTRCR后，产物经琼脂糖凝胶电泳，从凝胶图像上可以看到，大鼠GH3 细胞有OBR, OBRa和OBRb的表达，3个条带与预期片段大小相符（图1）. 2.2Leptin可上调大鼠GH3细胞OBRa和OBRb mRNA的表达半定量RT

13、PCR实验结果显示，Leptin（10-8 mol/L）作用于体外培养的大鼠GH3 细胞48 h后其受体OBRa 和OBRb mRNA表达分别增加至（154±11）和（188±9），可显著上调大鼠GH3细胞OBRa和OBRb mRNA的表达（图2）. 3讨论 1994年，Zhang等用定位克隆技术克隆了小鼠的肥胖基因(ob gene)及人类的同源序列，基因编码产生由167个氨基酸残基构成的蛋白质，N端有由21个氨基酸残基构成的信号肽，信号肽切割后成为由146个氨基酸组成的成熟蛋白质，即为Leptin，是调节体重和摄食的一个重要因素5-6. Lin等4发现在猪的垂体前叶有长型

14、Leptin受体的表达，在人垂体中也有OBRb mRNA的表达. 免疫组织化学双染色显示在大鼠垂体前叶有OBR和垂体激素表达的双重定位7，表明主要属生长激素（GH）分泌细胞(97.4±1.3)%（GH阳性细胞/OBR阳性细胞），而催乳素分泌细胞、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素和促甲状腺激素/黄体生成素阳性细胞不到1%. GH不仅参与机体的生长发育，通过影响能量代谢对机体组成和脂肪分布也起着一定作用，有关Leptin对GH影响的研究越来越多的被人们关注. 我们的实验结果显示，在大鼠GH3细胞上有OBR的表达，包括其长型(OBRb),短型(OBRa)和通用型(OBR)受体mRNA的表达，

15、提示Leptin可能通过其在GH3细胞上的相应受体直接调控GH3细胞的功能，影响GH3细胞的生长和GH的分泌. 很多生理性或病理性因素能影响受体的亲和性、受体数量、膜受体传递信息的能力和激素作用的受体后环节，这些调节可以造成激素反应的脱敏或超敏现象. 对许多内分泌细胞来说，激素与受体的结合增加了受体进入细胞内的速度，因此，增加细胞内和被分解的受体数量，加快受体分解，最终导致细胞表面受体数量的减少，这是一种负反馈调节. 虽然大多数激素诱导其受体下调，但也有一些激素如催乳素，起到正向同源性调节作用. 例如，用催乳素刺激肝细胞能增加催乳素受体合成及受体数量，加强细胞对这个激素的反应. 除了直接调节受

16、体，激素与受体的结合还能引起其他形式的调节，它可以发生在受体水平、 受体后水平或两者皆有. 半定量RTPCR实验结果发现Leptin可上调大鼠GH3细胞中Leptin受体基因的表达，增加OBRa和OBRb mRNA的含量，该作用与通常的激素对其受体的反馈性下调不一致，有可能对其受体起到正向同源性调节作用，考虑这可能与Leptin抵抗有关系. 肥胖患者的血清Leptin水平很高，但因Leptin抵抗无法实现其调控能量代谢和体质量的作用，那么Leptin受体的上调是否与肥胖患者发生leptin抵抗有关？这一结果为肥胖的研究提供了一个新思路，对于研究肥胖及其相关疾病有一定意义. 但是另一方面转录后还

17、要经过修饰、加工和翻译过程，Leptin对GH3细胞Leptin受体蛋白水平的影响我们并未检测，虽然其mRNA水平上调，但其转录后的翻译、修饰等过程最终形成有功能的能结合leptin 并将信号传入细胞内的受体蛋白量的变化尚不清楚，其受体蛋白水平有可能会升高或降低. 关于受体蛋白水平的变化有待进一步的检测. 【参考文献】 1Yonekura S, Senoo T, Kobayashi Y, et al. Effects of acetate and butyrate on the expression of leptin and shortform leptin receptor in bovi

18、ne and rat anterior pituitary cellsJ. Gen Comp Endocrinol, 2003, 133(2):165-172. 2Adam CL, Archer ZA, Findlay PA, et al. Hypothalamic gene expression in sheep for cocaine and amphetamineregulated transcript, proopiomelanocortin, neuropeptide Y, agoutirelated peptide and leptin receptor and responses

19、 to negative energy balanceJ. Neuroendocrinology, 2002, 75(4):250-256. 3Jin L, Burguera BG, Couce ME, et al. Leptin and leptin receptor expression in normal and neoplastic human pituitary evidence of a regulatory role for leptin on pituitary cell proliferationJ. J Clin Endocrinol Metab, 1999, 84:2903-2911. 4Lin J, Barb CR, Kraeling RR, et al. Growth hormone