第三章层析分离法

1、13级应用化学专业第三章第三章 层析分离法层析分离法第一节第一节 柱色谱柱色谱 第二节第二节 纸色谱纸色谱 第三节第三节 薄层色谱薄层色谱 13级应用化学专业目的及要求：目的及要求：1.了解层析分离法的基本概念和分类（层析法、柱色谱、纸色了解层析分离法的基本概念和分类（层析法、柱色谱、纸色谱和薄层色谱）；谱和薄层色谱）；2.掌握三种层析分离法的基本原理（柱色谱、纸色谱和薄层色掌握三种层析分离法的基本原理（柱色谱、纸色谱和薄层色谱）；掌握两类运算（柱色谱的塔板理论的有关计算，纸色谱谱）；掌握两类运算（柱色谱的塔板理论的有关计算，纸色谱和薄层色谱的比移值的计算）；和薄层色谱的比移值的计算）；3.关

2、注层析分离法的应用（对离子系统分析、氨基酸的分离和关注层析分离法的应用（对离子系统分析、氨基酸的分离和钴盐中镍的检出）。钴盐中镍的检出）。重点和难点：重点和难点：重点：重点：吸附柱色谱；液相色谱的基本理论；纸色谱原理、移动吸附柱色谱；液相色谱的基本理论；纸色谱原理、移动 速率及其影响因素；薄层色谱的原理和特点；速率及其影响因素；薄层色谱的原理和特点；难点：难点：纸色谱的移动速率及其影响因素纸色谱的移动速率及其影响因素。第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业 1 1、定义：、定义：层析层析法亦称法亦称色谱色谱层析法、色谱层析法、色谱法、色层法。法、色层法。利用样品中各组分的物理、利

3、用样品中各组分的物理、化学性质的化学性质的质的差别质的差别，使各，使各组分以组分以不同程度分布在两个不同程度分布在两个相中相中，其中一个相为固定的，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动则流过此固定相（称为流动相）并相）并使各组分以不同速度使各组分以不同速度移动移动，从而达到分离，这种，从而达到分离，这种分离方法就叫做层析法。分离方法就叫做层析法。第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业色谱分离图示 13级应用化学专业层析的发展史层析分类层析分类 13级应用化学专业以气体作为流动相以气体作为流动相以液体作为流动相以液体作为流动相气

4、气相相层层析析液液相相层层析析气气- -固固 气气- -液液1. 1. 按按两相所处的状态两相所处的状态分：分： 超临界流体为流动相的超临界流体为流动相的 色谱为色谱为超临界流体色谱超临界流体色谱 （SFC）。）。 随着色谱工作的发展，随着色谱工作的发展， 通过化学反应将固定液通过化学反应将固定液 键合到载体表面，这种键合到载体表面，这种 化学键合固定相的色谱化学键合固定相的色谱 称称化学键合相色谱化学键合相色谱 （CBPC）。）。液液- -固固 液液- -液液色谱法的分类色谱法的分类第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业2.按按层析的机制层析的机制分：分：凝胶凝胶层析层析亲和亲

5、和层析层析离子交换离子交换层析层析吸附吸附层析层析分配分配层析层析金属螯合金属螯合层析法层析法疏水疏水层析法层析法反相反相层析法层析法聚焦聚焦层析法层析法灌注灌注层析法层析法第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业（1）吸附层析）吸附层析 (absorption chromatography) 利用吸附层析介质表面的活性分子利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。吸附层析。第三章第

6、三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业（2）分配层析）分配层析(partition chromatography) 被分离组分在固定相被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法，异而进行分离的一种方法，称之为分配层析。称之为分配层析。 第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业（3）离子交换层析）离子交换层析(ion exchange chromatography

7、) 利用固定相介质表面活性基团，经化学键合方法，将利用固定相介质表面活性基团，经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团固定在固定相上面，这些离子基具有交换能力的离子基团固定在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离，称为离子交换层析。离，称为离子交换层析。第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业 （4）凝胶层析）凝胶层析（gel chromatography) 利用凝胶层析介质利用凝胶层析介质(固定相固定相)交联度的不同所形成的网状交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物

8、大分子通孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为凝胶层析。方法，称之为凝胶层析。 第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业（5）亲和层析）亲和层析 (affinity chromatography) 在固定相载体表面偶联在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。称之为亲和层

9、析。第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业 （6）金属螯合层析）金属螯合层析(metal chelating chromatography) 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而物发生特异螯合作用而 进行分离的方法，称之进行分离的方法，称之 为金属螯合层析。为金属螯合层析。第三章第三章 层析分离法层析分离法1

10、3级应用化学专业（7）疏水层析）疏水层析(hydrophobic chromatography) 利用固定相载体上偶利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。法，称之为疏水层析。第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业（8）反相层析）反相层析(reverse phase chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基，在一定利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基，在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非非极性的溶剂中

11、能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法，称之为反相层析。物质的方法，称之为反相层析。 （9）聚焦层析）聚焦层析(focusing chromatography) 利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子，在层利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子，在层析过程中所形成的析过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分梯度，并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反应进行分离的方法，称之为聚焦层析。子发生聚焦反应进行分离的方法，称之为聚焦层析。（10）灌注层析）灌注层析(perfusion

12、 chromatography) 利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法，称孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法，称之为灌注层析。之为灌注层析。第三章第三章 层析分离法层析分离法几种色谱法的异同点 13级应用化学专业3.按按操作形式操作形式不同分：不同分：柱柱层析层析薄层薄层层析层析纸纸层析层析薄膜薄膜层析层析柱柱层层析析第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业圆形滤纸圆形滤纸长条滤纸长条滤纸加展开液加展开液第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业薄层层析薄层层

13、析第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业基本特点：基本特点：(1) (1) 高选择性；高选择性；(2) (2) 高效能；高效能；(3) (3) 高灵敏度；高灵敏度；(4) (4) 高速度；高速度；(5) (5) 主要用于实验室。主要用于实验室。第三章第三章 层析分离法层析分离法13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱1. 吸附柱色谱吸附柱色谱2. 分配柱色谱分配柱色谱3. 柱色谱的操作柱色谱的操作4. 液相色谱的基本理论液相色谱的基本理论 13级应用化学专业一、吸附柱色谱一、吸附柱色谱第一节第一节 柱色谱柱色谱原理：原理：层析过程中，主要发生物理吸附。 物理吸附普遍性、无选择

14、性。物理吸附普遍性、无选择性。当固体吸附剂与多元溶液接触时，可吸附溶剂分子，也可吸附任何溶质分子； 吸附过程是可逆的。吸附过程是可逆的。被吸附的物质在一定条件下可以被解吸、而解吸与吸附的无选择性和相互关连性使吸附过程复杂化。 各组分吸附各组分吸附能力不同能力不同无数次吸附无数次吸附和解吸和解吸吸附力弱的组分向前移动吸附力弱的组分向前移动吸附力强的组分滞留在后吸附力强的组分滞留在后不同的移动不同的移动速率速率分离分离13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱1、吸附等温线、吸附等温线 在一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。 线性线性凸形凸形凹形

15、凹形分类分类13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱msCC msDCCK吸附平衡吸附平衡13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱2、吸附剂及其选择、吸附剂及其选择 利用溶质在固定相固定相( (吸附剂吸附剂) )和流动相流动相( (洗脱剂洗脱剂) )中的可逆平衡，以及吸附剂对不同物质吸附能力的差异进行分离。 具有较大的表面积和一定的吸附能力。 对不同的组分有不同的吸附量，因而能较好地把试样中 各组分分离。 在所用的溶剂和洗脱剂中不溶解。 与试样中各组分、溶剂及洗脱剂不起化学反应。 颗粒均匀，细度一定，使用过程中不会碎裂。1）对吸附剂的要求）对吸附剂的要求13级应用化学专业2）常用吸附剂

16、）常用吸附剂(1) 氧化铝氧化铝由Al(OH)3在300400oC(马弗炉中)加热34小时脱水制得。吸附机理：吸附机理：Al-OH基的氢键作用Al-O键束缚的Al原子的吸附作用静电吸附作用酸性氧化铝 (pH=3.54.5)中性氧化铝 (pH=6.97.1)碱性氧化铝 (pH=9.010.0)分类：分类：100150 oC300400 oC150300 oC600 oC，结构改变，吸附力下降第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱(2) 硅胶硅胶 在硅酸钠的水溶液中加入盐酸后得到的一种胶状缩水硅胶(SiO2.xH2O)，在100120 oC脱水形成的多孔吸附剂。硅氧

17、烷 游离型硅醇基 束缚型硅醇基 活泼型硅醇基 105110 oC活化活化30min（最佳条件）（最佳条件）200 oC13级应用化学专业硅胶可硅胶可静电吸附静电吸附可水解的金属离子可水解的金属离子pH7，Mn+水解产物带负电荷，Si-OH离解带负电荷，吸附作用下降；pH=27，Mn+水解产物带正电荷，Si-OH离解带负电荷，吸附作用增强。对易水解的金属元素吸附能力强；对不易水解的金属元素吸附能力弱。第一节第一节 柱色谱柱色谱硅胶对金属离子的吸附硅胶对金属离子的吸附阳离子交换性质阳离子交换性质13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱(3)聚酰胺聚酰胺 由己内酰胺聚合而成，因而又称聚己内酰胺，

18、或称锦纶。 层析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末。 形成分子内氢键形成氢键基团多形成氢键的两个基团的位置芳香核、共轭双键多活性炭、碳酸钙、氧化镁、硅藻土等活性炭、碳酸钙、氧化镁、硅藻土等13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱3、流动相及其选择、流动相及其选择 洗脱作用的实质洗脱作用的实质流动相分子与被分离溶质分子竞争占据 吸附剂表面活性位置的过程。强极性的流动相分子，洗脱作用强；弱极性的流动相分子，洗脱作用弱。三个考虑因素：三个考虑因素：(1) 被分离物质的结构和性质被分离物质的结构和性质烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯酮醛硫醇胺酰胺醇酚羧酸 极性顺序：极性顺序：13级应用化学专业第一节第一

19、节 柱色谱柱色谱(2) 吸附剂的性能吸附剂的性能石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸 级级级级级(3) 流动相的极性流动相的极性极性顺序：极性顺序：13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱二、分配柱色谱二、分配柱色谱 原理：原理：根据欲分离组分在两种互不混溶(或部分混溶)溶剂间 溶解度的差异进行分离。两种溶剂两种溶剂固定相固定相流动相流动相被吸收到惰性固体物质(担体)上。1、分配系数和比移值、分配系数和比移值msDCCK分配系数分配系数硅胶硅胶13级应用化学专业比移值比移值RfR一个分子单位时间内在流动相中停留的时间分数。（1-R） 一

20、个分子单位时间内在固定相中停留的时间分数。MSDMMSSVVKVCVCRR-1=MSDVVK+1=R1MSDVVK+11=R溶质分子和流动相分子在层析柱中移动速度的相对值。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱2、分配柱层析的担体、固定相和流动相、分配柱层析的担体、固定相和流动相 1）担体）担体硅胶、纤维素、硅藻土、多孔玻璃珠硅胶、纤维素、硅藻土、多孔玻璃珠3）流动相）流动相2）固定相）固定相仅起负载固定相的作用，本身是惰性的。仅起负载固定相的作用，本身是惰性的。水或强极性溶剂水或强极性溶剂与水不相混溶的有机溶剂与水不相混溶的有机溶剂用水饱和用水饱和13级应用化

21、学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱三、柱色谱的操作三、柱色谱的操作1、干法装柱、干法装柱2、湿法装柱（配播操作视频）、湿法装柱（配播操作视频）干法装柱：直接往柱子里填入吸附剂（如硅胶），然后再干法装柱：直接往柱子里填入吸附剂（如硅胶），然后再轻轻敲打柱子两侧，至轻轻敲打柱子两侧，至吸附剂吸附剂界面不再下降为止，反复操界面不再下降为止，反复操作至填入的作至填入的吸附剂吸附剂至合适高度，最后再用油泵抽气，压实至合适高度，最后再用油泵抽气，压实柱子。装毕用淋洗剂柱子。装毕用淋洗剂“走柱子走柱子”，一般淋洗剂是采用，一般淋洗剂是采用TLCTLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面分析得到的

22、展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。 问题：问题：“走柱子走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热，时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热，容易产生气泡，严重时，整个柱子变花，即发生沟流，样容易产生气泡，严重时，整个柱子变花，即发生沟流，样品不可能平整地通过，分离失败。品不可能平整地通过，分离失败。 解决方法：解决方法：1 1、硅胶一定要压实；、硅胶一定要压实；2 2、一定要用较多的溶剂、一定要用较多的溶剂“走柱子走柱子”，直至柱子的下端不，直至柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。再发烫，恢复到室温后再撤去压

23、力。*干法上样、湿法上样干法上样、湿法上样13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱四、液相色谱的基本理论四、液相色谱的基本理论基本组成基本组成13级应用化学专业基本组成和工作流程基本组成和工作流程13级应用化学专业常用术语常用术语(2) 色谱峰色谱峰：当某组分从色谱柱中流出时，检测器对该组分的响应信号：当某组分从色谱柱中流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线即为该组分的色谱峰。当进样量很低时，随时间变化所形成的峰形曲线即为该组分的色谱峰。当进样量很低时，色谱峰一般呈高斯分布。色谱峰一般呈高斯分布。(1)色谱流出曲线色谱流出曲线试样中各试样中各组分经色谱柱分离后，依次流组

24、分经色谱柱分离后，依次流入检测器，检测器将各组分浓入检测器，检测器将各组分浓度变化转化为电信号，在记录度变化转化为电信号，在记录仪上记录为检测器响应信号随仪上记录为检测器响应信号随时间变化的曲线。时间变化的曲线。第一节第一节 柱色谱柱色谱1、基本保留方程式、基本保留方程式13级应用化学专业 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。反映检无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。反映检测器噪声随时间变化的曲线。测器噪声随时间变化的曲线。(3) 基线基线稳定的基线是一条直线，如图中的稳定的基线是一条直线，如图中的CD。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业(4) 峰高峰高从色谱峰顶点到基线

25、的距离叫峰高，以从色谱峰顶点到基线的距离叫峰高，以 h 表示，表示，AB段。段。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业(5) 色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，它反色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。其宽度映了色谱操作条件的动力学因素。其宽度越窄越好越窄越好，是色谱，是色谱流出曲线的重要参数之一，可以反映出色谱柱的分离性能。流出曲线的重要参数之一，可以反映出色谱柱的分离性能。 表示方法有：表示方法有：标准偏差标准偏差 （它是（它是0.607倍峰高处色谱峰宽的一半）倍峰高处色谱峰宽的一半）半高峰宽半高峰

26、宽W（ W = 2.354 ）色谱峰底宽色谱峰底宽Wb（ Wb = 4 ）第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业标准偏差标准偏差 （它是（它是0.607倍峰高处色谱峰宽的一半）倍峰高处色谱峰宽的一半）EF的一半的一半半高峰宽半高峰宽W：是在峰高一半处的色谱峰的宽度，单位可用时间或距离表示。是在峰高一半处的色谱峰的宽度，单位可用时间或距离表示。 （ W = 2.354 ）在流出曲线两侧拐点处作切在流出曲线两侧拐点处作切线，与基线相交于两点，此线，与基线相交于两点，此两点间的距离叫色谱峰底宽，两点间的距离叫色谱峰底宽，简称简称“峰底宽度峰底宽度”。色谱峰底宽色谱峰底宽Wb（ Wb = 4 ）

27、第一节第一节 柱色谱柱色谱GH13级应用化学专业(6) 保留值保留值（Retation Value）是试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，它反映了组分与是试样各组分在色谱柱中保留行为的量度，它反映了组分与固定相间作用力大小，通常用保留时间和保留体积表示。固定相间作用力大小，通常用保留时间和保留体积表示。保留值是总称，具体参数的名称有以下一些保留值是总称，具体参数的名称有以下一些 第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业保留时间（保留时间（tR）试样从进样开始到柱后出现试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图称为保留时间，如图OB。它相应于样

28、品到达柱末端的它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。检测器所需的时间。指某组分通过色谱柱所需要的时间，即从进样到出现某组分色谱峰指某组分通过色谱柱所需要的时间，即从进样到出现某组分色谱峰最大值的时间，单位为最大值的时间，单位为 min 或或 s。在一定的色谱体系和操作条件下，任何一种化合物都有一定的保留在一定的色谱体系和操作条件下，任何一种化合物都有一定的保留时间，这是色谱定性分析的依据。时间，这是色谱定性分析的依据。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业死时间（死时间（ t0 ）不被固定相吸附或溶解的不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值

29、所需的样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图中时间称为死时间，如图中 OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速流动速度相近测定流动相平均线速 时，可用柱长时，可用柱长 L 与与t0 的比值的比值计算。计算。0tLu 第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业调整保留时间调整保留时间（Adjust Retation Time，t R）某组份的保留时间扣除死时间后某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间称为该组份的调整保留时间0tttRR它反映了组分在色谱过程中，与固定

30、相相互作用所消耗的时间，是它反映了组分在色谱过程中，与固定相相互作用所消耗的时间，是各组分产生差速迁移的物理化学基础。各组分产生差速迁移的物理化学基础。由于组份在色谱柱中的保留时间由于组份在色谱柱中的保留时间 tR 包含了组份随流动相通过柱子所包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR 实际上是组份实际上是组份在固定相中停留的时间。在固定相中停留的时间。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业保留体积（保留体积（ VR）指从进样开始到被测组份在指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通柱后出现浓度极大点时所

31、通过的流动相体积。过的流动相体积。F0 为流动相流速。为流动相流速。 保留体积与保留时间保留体积与保留时间 tR 的关系如下：的关系如下： 0FtVRR第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业 死体积死体积 （VM） 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速体积流速 F0（Lmin）计算：）计算：00FtVM第一节第一

32、节 柱色谱柱色谱调整保留体积（调整保留体积（VR）某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积。某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积。MRRVVV13级应用化学专业 色谱曲线的意义色谱曲线的意义 色谱峰数色谱峰数 = 样品中单组分的最少个数；样品中单组分的最少个数； 色谱保留值色谱保留值 定性依据；定性依据； 色谱峰高或面积色谱峰高或面积 定量依据；定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度 色谱柱分离效能的评价指标；色谱柱分离效能的评价指标； 色谱峰间距色谱峰间距 固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。第一节第一节 柱色谱柱色谱

33、则对于任何色谱过程的基本保留方程式为则对于任何色谱过程的基本保留方程式为SDRSDMRVKVVKVV,即SmSmRSSmMmRVCCVVCVCVCV推导：推导：13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱2 、容量因子（分配比）、容量因子（分配比）MRMSDMMSSMSVVVVKVCVCmmk流动相中溶质的量固定相中溶质的量SDMMMSDMMMRMRVK+V=VVVK+V=Vk+V=V+V=V) k+1 (V=MMRV=V0= k) k1 (tt0R+=) k+1 (VL=tRVL=t00FtVRR00FtVM代入上式13级应用化学专业1212-1200DDRRKKkktttt相对保留值（分离

34、因子）相对保留值（分离因子）某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。相对保留值越大，说明固定相对组分的选择性越好。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业 右图说明了柱效和选择性对分离的影响。图中（a）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。图中（b）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。图中（c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。 第一节第一节 柱色谱柱色谱*柱效（column efficiency），是指色谱柱保留某一化合物而不使其扩散

35、的能力。13级应用化学专业 由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引入一个综合性指标分辨率Rs。分辨率是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。3、 分辨率分辨率)-(22112WWttRRRS 相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和的一半（谱带平均宽度）的比值。度总和的一半（谱带平均宽度）的比值。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业Rs值越大，表明相邻两组分分离越好。当Rs1时，两峰有部分重叠；当Rs1时，分离程度可达98；当Rs1.5时，分离程度可达99.7。通常用Rs=1.

36、5作为相邻两组分已完全分离的标志。 第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业)-(22112WWttRRRS)-(22112WWVVRRRS热力学性质动力学性质第一节第一节 柱色谱柱色谱以时间单位表示：以时间单位表示：以体积单位表示：以体积单位表示：热力学性质试样中各组分在两相间的分配情况试样中各组分在两相间的分配情况试样中各组分在色谱柱中的运动情况试样中各组分在色谱柱中的运动情况13级应用化学专业第一节第一节 柱色谱柱色谱假设：假设：1. 柱分成n段，N为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高度，柱长为L，则N=L/H2. 所有组分开始都加在第零号塔板上。3. 在每块塔板上被测物在两相间的平

37、衡是瞬间建立的。4. 流动相是以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每次恰好为一个塔板体积V。5. 在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组分的量无关。6. 沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。194 、塔板理论、塔板理论13级应用化学专业理论塔板数与色谱参数之间的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为： 单位柱长的单位柱长的塔板数越多塔板数越多，表明，表明柱效越高柱效越高。 用用不同物质不同物质计算可得到计算可得到不同的理论塔板数不同的理论塔板数。2tR2R)V(=)WV(16=N2tR2R)t(=)Wt(16=N第一节第一节 柱色谱柱色谱HLN =例：已知物质例：已知

38、物质A和和B在一个在一个30.0cm柱上的保留时间分别为柱上的保留时间分别为16.40和和17.63分钟分钟.峰宽为峰宽为1.11和和1.21mm,计算计算: (1) 柱分辨本领柱分辨本领; (2) 柱的平均塔板数目柱的平均塔板数目; (3) 塔板高度。塔板高度。 解解: (1) R=2(17.63-16.40)/(1.11+1.21)=1.06 (2) nA=16(16.40/1.11)2=3493 nB=16(17.63/1.21)2=3397 nav=(3493+3397)/2=3445=3.44103 (3) H=L/n=30.0/3445=8.70810-3cm =8.7110-3c

39、m13级应用化学专业塔板理论的特点和不足塔板理论的特点和不足 (1)当色谱柱长度一定时，塔板数当色谱柱长度一定时，塔板数 N越大越大(塔板高度塔板高度 H 越小越小)，被测，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用塔板数和塔板高不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用塔板数和塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的

40、分配系数数 KD 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业速率理论是在塔板理论的基础之上发展起来的，它吸收了塔板理论速率理论是在塔板理论的基础之上发展起来的，它吸收了塔板理论中中理论塔板高度理论塔板高度的概念，并与组分在两相间的扩散和传质联系起来，的概念，并与组分在两相间的扩散和传

41、质联系起来，采用随机模式描述组分在柱内的分离过程。采用随机模式描述组分在柱内的分离过程。5、速率理论、速率理论-色谱过程动力学理论色谱过程动力学理论组分在柱内的展宽受四种动力学过程的控制：组分在柱内的展宽受四种动力学过程的控制：涡流扩散、分子扩散涡流扩散、分子扩散（纵向分子扩散）、流动相传质（纵向分子扩散）、流动相传质和和固定相传质固定相传质。 1956年年Van Deemter等人提出了速率理论，以后等人提出了速率理论，以后Giddings等人又进等人又进一步加以补充完善。一步加以补充完善。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业H：理论塔板高度（柱效）：理论塔板高度（柱效）v：流动相的

42、线速度：流动相的线速度(cm/s)减小减小A、B、C 三项可提高柱效；三项可提高柱效；存在着最佳流速；存在着最佳流速；A、B、C 三项各与哪些因素有关？三项各与哪些因素有关？（1 1） 速率方程（范速率方程（范弟姆特方程式）弟姆特方程式）vCvBAH/式中式中A、B、C为常数，分别代表为常数，分别代表涡流涡流扩散项系数扩散项系数、分子扩散项系数分子扩散项系数和和传质传质阻力项系数阻力项系数。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业沟流扩散沟流扩散第一节第一节 柱色谱柱色谱原因原因流动相受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向。流动相受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向。 沟流扩散现象沟流扩散现

43、象13级应用化学专业 A = 2dp=Hp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子：固定相的填充不均匀因子 影响影响Hp的因素的因素： Hp与填充物颗粒大小与填充物颗粒大小dP和填充均匀性和填充均匀性(取决于填充物颗粒的大小分布和装柱情况取决于填充物颗粒的大小分布和装柱情况)有关有关,与流动相性与流动相性质、线速和组分无关。质、线速和组分无关。 减小沟流扩散提高柱效的减小沟流扩散提高柱效的有效途径有效途径：使用适当的粒度，且：使用适当的粒度，且颗粒均匀的担体，并尽量填充均匀。颗粒均匀的担体，并尽量填充均匀。第一节第一节 柱色谱柱色谱公式公式13级应用化学专业分

44、子扩散分子扩散第一节第一节 柱色谱柱色谱原因原因浓度梯度。浓度梯度。 B.相应的检测信号相应的检测信号A. 柱内谱带构型柱内谱带构型13级应用化学专业 B = 2Dm， Hd=B /v= 2Dm /v ：弯曲因子，填充柱内流动相扩散路径弯曲的校正因素。 反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。 Dm：试样组分分子在流动相中的扩散系数（cm2s-1）第一节第一节 柱色谱柱色谱影响影响B项的因素项的因素（1）组分保留时间组分保留时间：保留时间长，色谱峰扩张就越显著（2） Dm ：Dm反比于流动相相对分子量的平方根；流动相相对分子量大，Dm小 Dm随柱温增加而增加，反比于柱压。（3）弯曲

45、因子弯曲因子 ：填充物的存在造成扩散阻碍而引入的的校正系数。 ：是填充物的不均匀性造成的。13级应用化学专业传质过程传质过程第一节第一节 柱色谱柱色谱物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程，称为传质。物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程，称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。 13级应用化学专业若流动相传质过程缓慢，阻力较大，会导致色谱峰变宽。若流动相传质过程缓慢，阻力较大，会导致色谱峰变宽。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业固定相传质阻力：组分从两相界面扩散到固定相内部，达到平衡后固定相传质阻力：组分从两相界面扩散到固定

46、相内部，达到平衡后又返回两相界面时受到的阻力称为固定相传质阻力。又返回两相界面时受到的阻力称为固定相传质阻力。第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业 传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质系数（Cs），即 CCmCs第一节第一节 柱色谱柱色谱m2PmD/wd=CS2SD/qrd=Cm2PmD/vwd=HS2SD/vqrd=Hw：柱系数；dp：填充剂颗粒的直径；Dm：溶质在流动相中的扩散系数；Ds：溶质在固定相中的扩散系数；q：固定相的构型因素；d：固定相的液层厚度；r：不断随溶质和流动相的相对迁移速率变化而变化的数值。13级应用化学专业液液色谱速率板高方程液液色谱速

47、率板高方程 分子扩散项，流动相中传质过程引起的谱带扩张可忽略不计第一节第一节 柱色谱柱色谱msdpH+H+H+H=Hm2ps2MpD/vwd+D/vqrd+v/D2+d2=Hs2pspD/vqrd+d2=H+H=H13级应用化学专业（2 2）流动相流速对理论塔板高度（柱效）的影响）流动相流速对理论塔板高度（柱效）的影响 最佳流速最佳流速流动相流速高时：流动相流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速 ，H H ，塔板数，塔板数 ，柱效柱效 。流动相流速低时：流动相流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速

48、, ,H H ，塔板数，塔板数 ，柱效柱效 。H = A + B/v + Cv第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业H u 曲线与最佳流速：曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值。佳流速值。H = A + B/v + Cv以塔板高度以塔板高度 H 对应流动相流速对应流动相流速 u 作图作图，曲线最低点的流速即为，曲线最低点的流速即为最佳流速最佳流速。0CvBdvdH2CBuoptBC2AHmin第一节第一节 柱色谱柱色谱13级应用化学专业速率理论的要点速率理论的要点 (

49、1)组分分子在柱内运行的多路径与组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散涡流扩散、浓度梯度所造成的、浓度梯度所造成的分子扩分子扩散散及及传质阻力传质阻力使两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩使两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。展、柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、流动相种类、流动相流速可提高柱效。通过选择适当的固定相粒度、流动相种类、流动相流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。柱温对柱效及分离的影响。 (

50、4) 各种因素相互制约，如：各种因素相互制约，如： 流动相流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传流动相流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；质阻力项的影响增大，又使柱效下降； 柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。件，才能使柱效达到最高。第一节第一节 柱色谱柱色谱 可变因素可变因素 符号符号 单位单位 流动相的流速流动相的流速 v cms在流动相中的扩散系数在流动相中的扩散系数 DM cm2s在固定相中的扩散系数在固定相中的扩散系数

51、 DS cm2s填料的直径填料的直径 dp cm液膜的厚度液膜的厚度 df cm溶质的脱附速度溶质的脱附速度 td s柱子的直径柱子的直径 dc cm色谱中影响柱效的因素色谱中影响柱效的因素 影响峰扩展的各种动力学因素影响峰扩展的各种动力学因素涡流扩散涡流扩散 A A纵向扩散纵向扩散 B/vB/v液体固定相中传质项液体固定相中传质项 Cs.v Cs.v 流动相中传质阻力项流动相中传质阻力项 C CM M.v .v 13级应用化学专业我院使用的仪器：我院使用的仪器：13级应用化学专业TOF的基本原理的基本原理*飞行时间质谱仪飞行时间质谱仪 Time of Flight Mass Spectrom

52、eter (TOF)配播配播TOF工作原理视频工作原理视频13级应用化学专业第二节第二节 纸色谱法纸色谱法 纸色谱法原理纸色谱法原理移动速率及其影响因素移动速率及其影响因素展开溶剂展开溶剂操作方法操作方法应用示例应用示例13级应用化学专业原理：原理：根据溶质根据溶质A在流动相与固定相（纸纤维中吸着的水分）在流动相与固定相（纸纤维中吸着的水分）中的分配系数不同，流动相因毛细现象沿纸上升，中的分配系数不同，流动相因毛细现象沿纸上升，KD大的大的前进慢，前进慢，KD小的上升快，因而溶质得到分离。小的上升快，因而溶质得到分离。DAAK 固固定定相相流流动动相相固定相固定相滤纸上的吸附水滤纸上的吸附水

53、( (或用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇处理或用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇处理) )流动相流动相溶剂溶剂 （乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶的溶剂）（乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶的溶剂）（分配色谱和吸附色谱）（分配色谱和吸附色谱）一一 基本原理基本原理第二节第二节 纸色谱法纸色谱法 纸色谱是以滤纸为载体的纸色谱是以滤纸为载体的液液-液分配色谱液分配色谱。滤纸由纤维。滤纸由纤维素制成，其分子中具有很多羟基，有较强的亲水性，能吸素制成，其分子中具有很多羟基，有较强的亲水性，能吸收收2025%的水分，其中的水分，其中6%左右的左右的水分水分通过氢键与纤维素通过氢键与纤维素上的羟基相结合形成的上的羟基相结

54、合形成的固定相固定相。 若要分离非极性物质可用适当的低级性液体如石蜡油、若要分离非极性物质可用适当的低级性液体如石蜡油、硅油等处理滤纸。硅油等处理滤纸。13级应用化学专业分离示意图分离示意图AB上行法上行法原点原点展开后展开后斑点斑点溶剂溶剂前沿前沿xxyy二二 移动速率及其影响因素移动速率及其影响因素第二节第二节 纸色谱法纸色谱法 13级应用化学专业原点原点展开后展开后斑点斑点溶剂溶剂前沿前沿xxyy1 比移值比移值原点至斑点中心间的距离原点至斑点中心间的距离(cm)原点至溶剂前沿间的距离原点至溶剂前沿间的距离(cm)Rf=组分组分A组分组分ByxxRfyxxRfmsDfVVKR11第二节第

55、二节 纸色谱法纸色谱法 13级应用化学专业定性检出氨基蒽醌试样中的各种异构体定性检出氨基蒽醌试样中的各种异构体样品：样品： 氨基蒽醌氨基蒽醌固定相：固定相： - -溴代萘附着于滤溴代萘附着于滤纸纤维素上纸纤维素上. .展开剂：展开剂：吡啶吡啶: :水（水（1:11:1）1,7- -氨基蒽醌氨基蒽醌1, 6-氨基蒽醌氨基蒽醌1, 8- -氨基蒽醌氨基蒽醌1-1-氨基蒽醌氨基蒽醌硝基蒽醌硝基蒽醌溶剂前沿溶剂前沿原点原点第二节第二节 纸色谱法纸色谱法 13级应用化学专业第二节第二节 纸色谱法纸色谱法 （1） 温度温度影响物质在两相间的溶解度影响分配系数影响滤纸纤维的水合作用影响固定相的体积在室温范围

56、内影响很小。2 影响影响Rf值的主要因素值的主要因素 在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统的含水在多元溶剂系统中，温度显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。所以温度的改变使量，即影响流动相的组分比例。所以温度的改变使Rf值变值变化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。化很大，为此，层析必须在恒温条件下进行。 某些对温度敏感的溶剂系统，最好不要配成饱和溶液。某些对温度敏感的溶剂系统，最好不要配成饱和溶液。如水饱和的酚溶液，可改成酚如水饱和的酚溶液，可改成酚 水水 4 1或或5 1等。等。 13级应用化学专业（2） 滤纸种类的影响滤纸种类的影响应满足条件：a.滤纸中应不含有水或有

57、机溶剂能溶解的杂质。b.滤纸被溶剂浸润时，不应有机械折痕和损伤，即应具有一定的强度。c.滤纸对溶剂的渗透速度要适当，渗透速度太快时易引起斑点拖尾， 影响分离效果，速度太慢，则耗费时间太长。d.纸质应均一，否则会影响重现性，特别是对定量工作这点尤为重要。 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同，因此结合的水水量量不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号不一样，两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时，所得到的的滤纸上进行层析时，所得到的Rf值也不相同。此外，滤纸上所值也不相同。此外，滤纸上所含的含的杂质杂质也

58、会影响也会影响Rf值，必要时要进行预处理，以去除杂质的影值，必要时要进行预处理，以去除杂质的影响。例如：可用响。例如：可用0.01-0.4mol/L的的HCl处理滤纸，以除去滤纸上的处理滤纸，以除去滤纸上的金属离子，然后再用水洗至中性。金属离子，然后再用水洗至中性。 国产新华滤纸、日本东洋滤纸等均经常被采用。国产新华滤纸、日本东洋滤纸等均经常被采用。 13级应用化学专业滤纸的选用滤纸的选用第二节第二节 纸色谱法纸色谱法 13级应用化学专业h2=Dt（3） 展开距离展开距离第二节第二节 纸色谱法纸色谱法 13级应用化学专业（4） 共存物质及试样溶液性质共存物质及试样溶液性质 样品溶液中存在杂质时

59、，有时对样品溶液中存在杂质时，有时对Rf值有所影响。例如：值有所影响。例如：氯化钠的存在会影响氨基酸的氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf 值。值。 溶剂和样品的溶剂和样品的pH值会值会影响物质的解离影响物质的解离，从而影响物质的极，从而影响物质的极性和溶解度，使性和溶解度，使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高，使极性物质的量增高，使极性物质的Rf值增加；反之则降低。值增加；反之则降低。 为了避免或减少为了避免或减少pH值对值对Rf值的影响，可将滤纸和溶剂用缓值的影响，可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理，使之保持一定的冲溶液处理，使之保持一定的pH值，通

60、过调节溶剂或样品溶值，通过调节溶剂或样品溶液的液的pH值，使值，使pH值保持恒定。值保持恒定。 （5）物质的结构和极性）物质的结构和极性 物质的结构和分子极性是影响物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。值的主要因素。极性较极性较大大的物质，在水中的溶解度较大，的物质，在水中的溶解度较大，其其Rf值就较小值就较小，反之亦然。，反之亦然。13级应用化学专业（6）层析所用的溶剂）层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时，Rf值不同。所以溶剂值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格，才能使的配制和使用必须严格，才能使Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中